临床毒理学杂志
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白虾急性肝胰腺坏死病副溶血性弧菌K5株PirA基因的克隆及其在大肠杆菌宿主细胞中的表达

阮文庆、陈国勇、陈光庆、阮光灵

急性肝胰腺坏死病（AHPND）是白腿虾的一种细菌性疾病，死亡率高（100%），经济损失巨大。我们的目标是确定导致细胞和器官毒性损伤的基因，并应用生物产品来预防它。从越南中部一个受感染的池塘收集南美白对虾，并在顺化大学生物技术研究所进行分析。分离副溶血弧菌K5菌株的PirA基因并分析其核苷酸序列，与表达载体pQE30配对。将表达载体转化至大肠杆菌菌株M15中，即PirA重组蛋白以约15kDa的6xHis-PirA融合蛋白的形式表达。纯化PirA重组蛋白，并用特异性引物和PirAvp及PirAvp复合物的分子量，通过PCR方法测定引起AHPND的副溶血性弧菌K5菌株的PirA基因的PirAvp结合率、克隆和测序。将副溶血弧菌K5 株的PirA基因克隆到 pGEM-T easy 载体（Promega，美国）中，并筛选含有 pGEM T easy/ PirA的大肠杆菌TOP10 菌落LB琼脂/氨苄青霉素/IPTG/X-Gal培养基上的重组质粒。PCR 显示一条约 347 bp 的条带，与PirA基因和两个核苷酸序列（BamHI 和 HindIII）的大小相匹配。结果显示，PirA基因长度为336 bp，与GenBank上的PirA基因（Code：KU556825.1）相似。从E. coli M15重组细胞中提取的蛋白和从EF2到EF6的洗脱组分中收集到的6xHis- PirA目的蛋白结果表明，6xHis- PirA蛋白和EF3洗脱组分中收集到的蛋白浓度最高（1,586.54 µg/毫升）。纯化的PirA重组蛋白将为开发研究提供材料，以创造预防和治疗 AHPND 的生物制品。