热力学与催化杂志
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小凹槽嵌入环的疏水性降低对于来自大西洋鳕鱼的冷适应尿嘧啶-DNA N-糖基化酶的有效催化至关重要

Elin Moe、Netsanet Gizaw Assefa、Ingar Leiros、Kathrin Torseth、Arne O Smalås 和 Nils Peder Willassen

尿嘧啶-DNA N-糖基化酶 (UNG) 中的小沟嵌入环（亮氨酸环）在与底物相互作用时会发生显着的构象变化。先前的研究表明，适应寒冷的大西洋鳕鱼UNG（cUNG）的催化效率比人类UNG（hUNG）高十倍。两种酶的序列比对揭示了 cUNG 亮氨酸环内及其附近的氨基酸取代，这可能增加了环的弹性，从而解释了所观察到的 cUNG 比 hUNG 更高的催化效率。为了研究这一假设，我们构建了 5 个单突变体和 4 个多重 cUNG 突变体，其中鳕鱼取代为人 UNG，并通过三种不同温度（15、22 和 37°C）的动力学实验和差示扫描量热法 (DSC) 对其进行表征。结果表明，突变对 kcat 的影响大于对 KM 的影响，疏水性明显降低的突变体（A266T、V267A、A266T/V267A 和 A266T/V267A/A274V）的 kcat 增加或与 cUNG 相当，而预计疏水性增加的突变体（A274V、H275Y、L279F、A266T/V267A/A274V/H275Y 和 A266T/V267A/A274V/H275Y/H250Q）与 cUNG 相比，kcat 降低。因此，模仿 hUNG 中亮氨酸环的氨基酸组成会降低 cUNG 的活性。进行 DSC 实验是为了确定由于亮氨酸环的疏水性改变而导致的突变体整体稳定性的潜在增加。然而，结果显示，kcat 增加的突变体的整体稳定性略有降低，kcat 减少的突变体的稳定性有所增加。我们认为这些结果源于需要补偿由氨基酸取代引入的亮氨酸环弹性的潜在增加/减少。这项研究证实了亮氨酸环对于 UNG 有效催化的重要性，并表明可以通过操纵该环的氨基酸组成来改变该酶的催化能力。