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精子特异性两步染料排除试验评估细胞质和细胞器膜的完整性——胞浆内精子注射质量保证的新方法

金子悟、冈田由纪、高松清

目的：对质膜和细胞器膜进行综合评估是了解人类精子生育力的新方法。本研究开发了两种精子特异性两步染料排斥试验来评估人类精子的质膜和细胞器膜。

方法：精子特异性两步染料排斥试验：将精子与活性红 195 (RR195) 或 Cy3 结合的刀豆球蛋白 A (Cy3-con A) 在等渗培养基中孵育，用甲醇分别排斥质膜后，用活性蓝 222 或 Alexa 488 结合的刀豆球蛋白 A 进行复染。通过 Mito Tracker FM 的保留观察线粒体中细胞器膜的完整性。cellROX Orange 在被活性氧氧化后产生橙色荧光。

结果：精子特异性两步染料排除试验包括第一种染料通过受损的质膜和细胞器膜渗透并与细胞核结合，膜排除后，新暴露的细胞核或内顶体膜与第二种染料复染。人类运动精子（活精子；LS）中完整的质膜和顶体膜排除RR195和Cy3-con A，但变性的质膜和顶体膜允许渗透。LS呈蓝色或产生绿色荧光，而变性的质膜分别产生红色或红色荧光。线粒体中Mito Tracker FM和cellROX Orange的荧光证明了具有完整细胞器膜的线粒体中氧化磷酸化的正常性。衍生的单步RR195排除试验是临床ICSI中术中无损评估运动精子的可行候选方法。

结论：染料排除和保留试验可作为术前精子质量的评估，而改进的单步染料排除试验可能有助于临床胞浆内精子注射中的术中精子选择。