遗传综合征与基因治疗杂志
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抽象的

用于治疗由大基因突变引起的疾病的片段化腺相关病毒双载体策略导致杂交转录本的表达

米歇尔·E·麦克莱门茨、彼得·查贝尔·伊萨、维罗妮克·布卢安和罗伯特·E·麦克拉伦

目的 双载体 AAV 系统可用于对疾病基因太大而无法装入单个衣壳的疾病进行基因治疗。含有单个反向末端重复序列截短的转基因的片段化腺相关病毒（fAAV）载体被认为是这样的一种基因替换策略。在这里，我们的目标是增加目前对 fAAV 双载体系统所采用的分子机制的理解。方法 将含有 ABCA4 编码序列的超大 (>8kb) 转基因构建体包装为大小 <5kb 的截短片段，装入各种 AAV 血清型中。使用这些 fAAV 载体制剂进行体外转导，并通过 RT-PCR、qPCR 和蛋白质印迹技术评估 mRNA 和蛋白质表达产物。结果用 fAAV 载体制剂转导产生了 ABCA4 mRNA，但没有产生可检测水平的蛋白质。转录物群体的测序揭示了全长 ABCA4 CDS 和其他杂交 ABCA4 变体的存在，表明没有重叠区域的截短转基因正在连接并形成稳定的杂交转基因。相比之下，具有确定互补区域的 ABCA4 重叠双载体系统 (OV) 仅生成全长 mRNA 转录物和可检测的 ABCA4 蛋白。结论 尽管 fAAV 方法之前取得了成功，但缺乏可重复性和能够产生蛋白质的稳定杂交转录本的鉴定，表明在临床环境中考虑这种方法之前需要进行更多的改进。转录物群体的测序揭示了全长 ABCA4 CDS 和其他杂交 ABCA4 变体的存在，表明没有重叠区域的截短转基因正在连接并形成稳定的杂交转基因。相比之下，具有确定互补区域的 ABCA4 重叠双载体系统 (OV) 仅生成全长 mRNA 转录物和可检测的 ABCA4 蛋白。结论 尽管 fAAV 方法之前取得了成功，但缺乏可重复性和能够产生蛋白质的稳定杂交转录本的鉴定，表明在临床环境中考虑这种方法之前需要进行更多的改进。转录物群体的测序揭示了全长 ABCA4 CDS 和其他杂交 ABCA4 变体的存在，表明没有重叠区域的截短转基因正在连接并形成稳定的杂交转基因。相比之下，具有确定互补区域的 ABCA4 重叠双载体系统 (OV) 仅生成全长 mRNA 转录物和可检测的 ABCA4 蛋白。结论 尽管 fAAV 方法之前取得了成功，但缺乏可重复性和能够产生蛋白质的稳定杂交转录本的鉴定，表明在临床环境中考虑这种方法之前需要进行更多的改进。具有确定互补区域的 ABCA4 重叠双载体系统 (OV) 仅生成全长 mRNA 转录物和可检测的 ABCA4 蛋白。结论 尽管 fAAV 方法之前取得了成功，但缺乏可重复性和能够产生蛋白质的稳定杂交转录本的鉴定，表明在临床环境中考虑这种方法之前需要进行更多的改进。具有确定互补区域的 ABCA4 重叠双载体系统 (OV) 仅生成全长 mRNA 转录物和可检测的 ABCA4 蛋白。结论 尽管 fAAV 方法之前取得了成功，但缺乏可重复性和能够产生蛋白质的稳定杂交转录本的鉴定，表明在临床环境中考虑这种方法之前需要进行更多的改进。