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丙型肝炎病毒基因组 3'-非翻译区中单链和双链 RNA 元件的原位定位方法

艾洛迪·兰斯、胡静、杰罗姆·E·坦纳和卡罗琳·阿尔菲里

解析RNA病毒基因组中天然状态的二级和三级结构的能力是阐明这些病毒复制过程的重要的第一步。丙型肝炎病毒 (HCV) 基因组由单 (+) 链 RNA 组成，其复制主要由 3'-非翻译区 (3'UTR) 控制。3'UTR 包含基因型特异性可变区 (VR)、聚 (U/UC) 重复序列和称为 X 尾的保守 98 个碱基序列。尽管已经提出了体外生化分析的 3'UTR 结构模型，但其作为存在于细胞内环境中的全长病毒基因组的一部分的天然结构尚不确定。在全长基因组的3'UTR处，我们结合定点 RT-qPCR 进行了原位化学标记。结果表明 ssRNA 在 VR-poly (U/UC) 重复序列中占主导地位，而 dsRNA 元件仅限于 X 尾。原位化学标签还鉴定了位于 VR-poly (U/UC) 重复区域中的独特 dsRNA 元件，该重复区域包含位于 3'UTR 外部的部分序列。这里描述的结果构成了 HCV 基因组 3'UTR 序列中存在的二级结构的原位探测和检测的第一份报告。使用细胞内 RNA 修饰剂来划分dsRNAssRNA 与 PCR 相结合，可以扩增痕量的目标 RNA，在绘制复杂细胞内 RNA 内的天然二级结构方面具有潜在的应用。