遗传工程的进展
开放获取

抽象的

一种在抗肌萎缩蛋白基因编码中引入特定点突变的新方法：PRIME 编辑技术。

塞德里克·哈皮·姆巴卡姆

抗肌营养不良蛋白基因突变会导致神经肌肉疾病，例如杜氏肌营养不良症，这是一种致命的 X 连锁遗传性疾病，每 10 万名男性新生儿中患病率为 19.8 例。目前可用的皮质类固醇或吗啉代反义寡聚物注射的临床疗法提供有限的表型改善。我们的研究旨在衡量 PRIME 编辑技术的效率。该技术使用编码与 Cas9H840A 切口酶融合的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的 PRIME 编辑质粒（PE2 或 PE3），以及编码包含引物结合位点（PBS）和逆转录酶模板（RTT）的 pegRNA 的质粒。它允许在基因组中进行特定的核苷酸取代、缺失或插入。我们设计了针对几个 hDMD 外显子（9、20、35,43、51、55、61)通过修饰单个核苷酸引入终止密码子。用PE2和pegRNA同时转染三天后，从DMEM培养基中收获HEK293T细胞。使用Sanger方法对外显子进行PCR扩增和测序。使用EditR程序分析结果以估计编辑百分比。我们确认 PRIME 编辑允许 DMD 基因中的特定 C 到 T 和 G 到 T 替换，编辑效率在 6 到 11 % (PE2) 和 21 % (PE3) 之间。第一次转染 6 天后重复转染高达 15 % ( PE2）版本位于外显子 9 和 35 中。PAM 序列（外显子 35）的额外突变将单次转染的 PE2 结果提高至 38%。因此，