遗传工程的进展
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在抗肌萎缩蛋白基因编码中引入特定点突变的新方法：PRIME编辑技术

塞德里克·哈皮·姆巴卡姆

抗肌营养不良蛋白基因突变会导致神经肌肉疾病，例如杜氏肌营养不良症，这是一种致命的 X 连锁遗传性疾病，每 10 万名男性新生儿中患病率为 19.8 例。目前可用的皮质类固醇或吗啉代反义寡聚物注射的临床疗法只能提供有限的表型改善。我们的研究旨在衡量 PRIMEediting 技术的效率。该技术使用编码莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶与Cas9 H840A切口酶融合的PRIME编辑质粒（PE2或PE3），以及编码含有引物结合位点（PBS）和逆转录酶模板（RTT）的pegRNA的质粒。它允许在基因组中进行特定的核苷酸替换、删除或插入。我们设计了针对多个 hDMDexon（9、20、35,43、51、55、61)通过修饰单个核苷酸引入终止密码子。在同时用 PE2 和 pegRNA 转染三天后，从 DMEM 培养基中收获 HEK293T 细胞。使用 Sanger 方法对外显子进行 PCR 扩增和测序。使用 EditR 程序分析结果以估计编辑百分比。我们确认 PRIME 编辑允许 DMD 基因中特定的 C 到 T 和 G 到 T 替换，编辑效率在 6% 到 11% (PE2) 和 21% (PE3) 之间。第一次转染后 6 天重复转染，外显子 9 和 35 的表达率高达 15% (PE2)。PAM 序列（外显子 35）的额外突变将单次转染的 PE2 结果提高至 38%。因此，