临床与实验眼科学杂志
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放大色谱信号和紫外吸收光谱法评估热变性后和隐形眼镜提取物中的溶菌酶

克劳德·J·贾森、丹妮尔·贝兰德和兰吉斯·米肖

目的：放大高效液相色谱（HPLC）测定隐形眼镜中提取的溶菌酶相关的吸光度信号；检查溶菌酶的纯度以及热变性对其洗脱曲线的影响程度。
方法：在将隐形眼镜提取物注入系统的试验色谱运行中，如蛋白质印迹所示，在 4 至 5.5 分钟之间收集的级分表明溶菌酶为洗脱蛋白。在 0.2% 三氟乙酸 (TFA): 乙腈 (ACN) 50:50 溶液中从隐形眼镜中提取蛋白质。将每种隐形眼镜提取物分成 2 等份。真空蒸发后，将 1 号等分试样溶解到初始流动相中，以产生 8 倍的富集因子。2 号等分试样在常规提取溶液中不进行处理。校准 220 nm 处的吸光度信号可以测量色谱图中的溶菌酶水平。将两个等分试样平行注射到 HPLC 中可以比较它们的溶菌酶含量。通过观察峰上的吸收光谱来评估提取的溶菌酶的纯度。注射预先加热至 80 和 100°C 的溶菌酶溶液，并与对照溶液进行比较。采用非参数方法测试了 1 号和 2 号等分试样之间的中值溶菌酶含量的差异以及与对照相比加热的溶菌酶峰面积的差异。
结果：富集提取物和常规提取物中测得的中位溶菌酶水平存在显着差异（分别为 39.8 和 21.5 μg）。然而，根据不同的进样量和浓缩系数进行校正后，平均富集溶菌酶水平 (21.4 μg) 接近于常规提取物中的水平。光谱吸光度的观察表明洗脱的溶菌酶不含污染物。通过符号秩检验，加热溶菌酶的峰面积与对照溶菌酶峰面积的中位比在 100°C 温度下与 1 (0.91) 显着不同，但在 80°C 温度下的 1 (0.95) 则没有显着差异。即使在 80°C 下加热，溶菌酶的洗脱曲线与对照相比似乎不太对称，并出现了额外的拐点。这些微妙的变化在 100°C 时会加剧。
结论：富集从隐形眼镜中提取并溶解到初始流动相中的溶菌酶可提高该色谱过程的灵敏度。该色谱方案与紫外吸收光谱相结合可以检测 80 和 100°C 的热变性。