蛋白质组学与生物信息学杂志
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使用化学交联质谱法分析酵母线粒体蛋白 Rim1 和 Pif1 之间的蛋白质相互作用界面

Boris Zybailov、Kuppan Gokulan、Jadon Wiese、Ramanagouda Ramanagoudr-Bhojappa、Alicia K. Byrd、Galina Glazko、Mihir Jaiswal、Samuel Mackintosh、Kottayil I. Varughese 和 Kevin D. Raney

定义蛋白质-蛋白质接触是一个具有挑战性的问题，而交联是一个有前途的解决方案。在这里，我们介绍了线粒体单链结合蛋白 Rim1 和解旋酶 Pif1 的案例，这是首次在使用 Pif1 诱饵从酵母细胞中进行免疫亲和力下拉时观察到的相互作用。我们发现只有短的琥珀酰亚胺基-二氮丙啶交联剂或甲醛捕获了重组 Rim1 和 Pif1 之间的相互作用。此外，Pif1 需要去除其 N 端和 C 端结构域，并且 Rim1 的 C 端需要进行修饰以使交联产物变得可见。我们的报告是一个重要分析的例子，

我们使用高分辨率质谱法来检测交联肽。使用 15N 和 14N 标记的 Rim1 的 1:1 混合物通过 LC-MS 曲线中的质量位移来验证交联。Rim1 上的两个位点得到确认：1) N 末端，2) K29 残基。使用 K29A 变体进行交联明显减少了交联产物。此外，与野生型 Rim1 相比，K29A-Rim1 对单链 DNA 的亲和力低五倍。K29A 变体和野生型 Rim1 对 Pif1 解旋酶活性的刺激程度相似。我们提出了 Pif1-Rim1 相互作用的结构模型并讨论了其功能意义。我们的工作代表了一种重要的蛋白质-蛋白质界面分析，并展示了短且非特异性交联剂的实用性。