克隆与转基因
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使用高灵敏荧光排除分析评估克罗胺（一种天然细胞穿透肽）与 DNA 之间的复合物形成

巴普蒂斯塔 GR、弗雷塔斯 VJF、阿尔坎塔拉-内托 AS、佩雷拉 AF 和坎佩洛 IS

Crotamine 是一种从南美响尾蛇 (Crotalus durissus terrificus) 毒液中分离出来的天然阳离子多肽，能够通过静电相互作用和易位生物膜与 DNA 分子形成复合物。凭借这些特性，克罗胺可以作为多种细胞类型的转染剂，但主要是在增殖阶段。然而，为了提高这种肽的生物用途，更好地表征克罗米纳-DNA 复合物的形成和稳定性是很有意义的。因此，本研究旨在基于荧光团排除测定，使用高灵敏荧光方法分析 Crotamina-EGFP 复合物的化学计量、形成动力学和蛋白酶稳定性。形成复合物的最佳 DNA: 巴罗胺质量比范围为 1:10 至 1:40。在 1 中：在第 10 组中，克罗胺能够在 20 秒内以最快的速度复合约 75% 的可用 DNA，反应 10 分钟后克罗胺达到其最大复合能力，能够复合可用 DNA 总量的 80%。在这些条件下，我们确定 1μg 克罗胺可以复合 80μg 环状质粒 DNA（约 4700 bp）。即使在酶孵育 12 小时后，克罗他胺-DNA 复合物仍能抵抗蛋白酶 K 的降解。此外，该复合物在较长的孵育时间内对胰蛋白酶消化足够稳定：超过 73% 的克罗胺-DNA 缩合物在 60 分钟后保持完整性，而 55% 在 180 分钟后保持完整。克罗他胺-DNA 复合物能够耐受生理温度，在 4°C 下可稳定保存 15 天，在 -20°C 下可稳定保存两个月。