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用于发现和表征 DNA 解旋酶抑制剂的生化和生物测定

小罗伯特·M·布罗什

抽象的

涉及遗传问题和恶性生长的解旋酶数量不断增加，这是它们在 DNA 交换、基因组安全和细胞稳态方面的基本工作的特征。毫无疑问，亚原子和细胞证据表明，解旋酶通过化学方式松开或重新设计各种核酸腐蚀性底物，并与各种蛋白质相互作用，以发挥其复制、DNA 固定、重组和记录的能力。了解解旋酶如何以一种独特的方式工作并覆盖路径对科学家来说是一项非凡的考验。平衡客观解旋酶协同运动的有机动态小原子的公认证据和描述，说明了一种处理人类细胞中解旋酶工作的独特方法。在本次调查中，我们描述了一系列识别和描述 DNA 解旋酶抑制剂的测试方法和策略，这些方法和策略总体上为研究它们在基于细胞的框架中的天然重要性提供了另一种选择和有价值的技术。这些策略被用于揭示自然动态加剧因素，这些因素阻碍了人类 WRN 解旋酶核酸酶在早熟问题 Werner 条件下催化的 DNA 解旋工作。我们对新发现的 WRN 显式解旋酶抑制剂的研究已经验证了原理证明，证明这些混合物如何与其他药理学操作者一起用于制造致命方法或在特征性遗传异常基础中使用。在本次核酸 2017 研讨会上，我将以 WRN 为模型描述处理解旋酶抑制剂的体外和体内测试方法，预见这些方法可能会外推到其他 DNA 解旋酶，特别是涉及 DNA 修复和复制应激反应的解旋酶。解旋酶抑制剂提供了一种选择性的方法来检查其目标的原子和细胞元素，并在更广泛的程度上，覆盖和满足 DNA 代谢途径的精细协调。此外，我的实验室和其他人将解旋酶视为适当的小颗粒，可以改善现有的癌症治疗方法或成为新型治疗药物。尤其是那些参与 DNA 修复和复制应激反应的人。解旋酶抑制剂提供了一种选择性的方法来检查其目标的原子和细胞元素，并在更广泛的程度上，覆盖和满足 DNA 代谢途径的精细协调。此外，我的实验室和其他人将解旋酶视为适当的小颗粒，可以改善现有的癌症治疗方法或成为新型治疗药物。尤其是那些参与 DNA 修复和复制应激反应的人。解旋酶抑制剂提供了一种选择性的方法来检查其目标的原子和细胞元素，并在更广泛的程度上，覆盖和满足 DNA 代谢途径的精细协调。此外，我的实验室和其他人将解旋酶视为适当的小颗粒，可以改善现有的癌症治疗方法或成为新型治疗药物。

介绍

对调节客观解旋酶 DNA 松弛能力的自然动态小颗粒的筛选和描述，为研究解旋酶在人类细胞中的作用提供了一种新方法。我们利用这种方法来研究WRN解旋酶核酸酶在早熟问题Werner条件下受损的原子和细胞成分。这些检查首先以基于体外辐射测量的解旋酶测量为指导，利用清洁的重组 WRN 蛋白，其中筛选了来自国家癌症研究所多样性集的约 500 种混合物。与 NCI 文库中的不同混合物相比，我们发现以中等高功率抑制 WRN 的一种加剧物是 1-(丙氧基甲基)-马来酰亚胺，指定为 NSC 19630 (IC50 ~ 20 μM)。确定了 WRN 解旋酶阻碍的能力，通过评估其对其他 DNA 解旋酶的影响，调查了在体外重点尝试抑制解旋酶的混合物的明确性。同样，还进行了 DNA 官方、ATP 酶和 WRN 核酸外切酶测试，以进一步描述特别阻碍 WRN 解旋酶作用的混合物。此外，还检查了所选 WRN 解旋酶抑制混合物对荧光动态 DNA 嵌入化合物噻唑橙的去除情况，以调查 NCI 多样性组中每种单独化合物与 WRN 解旋酶测试所用 DNA 底物结合的总体能力。这种努力有助于消除那些对 WRN 解旋酶作用的影响是通过其与 DNA 解旋酶底物的直接合作来干预的增强物，因此在本质上被认为是模糊的。

当细胞以WRN-从属方式引入WRN解旋酶抑制剂时，细胞增殖衰弱和固体DNA损伤表明，WRN解旋酶-镇静基因组DNA的有毒三元复合物可能在体内形成。显然，这种小颗粒将解旋酶动态 WRN 捕获在关键的 DNA 复制/修复过渡上，从而产生有害的染色质 DNA 镇静复合物。这种情况促使我们推测，在 WRN 抑制剂奖励的细胞中，受损的 WRN 将在染色质部分中进行推进。为了解决 WRN 抑制剂的这个问题，将 HeLa 细胞置于 NSC 617145 (0.75-2.0 μM) 或小原子可溶解的 DMSO (1%) 的扩展收敛物中 4 小时，随后按照生产商的建议（亚细胞蛋白分级分离装置，Thermo Scientific）在 -80 °C 下进行细胞冷冻，并由此准备好不同的亚细胞分裂。该方法包括在蛋白酶抑制剂混合溶液的视野内裂解精制哺乳动物细胞的基本连续步骤，以便原子可溶解和染色质结合的分裂可以在 2-3 小时内分离，滥用沉降的微球菌核酸酶的掺入来释放染色质结合的细胞来自其他原子蛋白质的蛋白质。然后，来自特定分区的溶解蛋白处于良好的结构，可迅速沉淀在变性倾向 (4-12%) 聚丙烯酰胺-SDS 凝胶上，并使用 WRN 小鼠单克隆中和剂（1:1000；Spring Valley）通过免疫印迹测试 WRN 蛋白实验室）。为了控制堆叠，同样测试了斑点的原子蛋白拓扑异构酶 I (BD Biosciences) 和组蛋白 H3 (Abcam)。该方法表明，与对照 DMSO 奖励细胞相比，呈递给 NSC 617145 的 HeLa 细胞在染色质部分显示出更显着的内源性 WRN 水平。

研究策略

基于遗传或合成驱动的工程致死是一种利用新型 DNA 修复抑制剂处理靶肿瘤的正在发展的方法。由于快速分离的恶性肿瘤细胞以比普通分离的细胞更显着的速度聚集复制损伤，因此疾病细胞可能非常容易加剧针对 DNA 修复硬件的恶化。我们一直热衷于这个想法，因为解旋酶在不同 DNA 修复途径的特定步骤中承担基本工作，并且是 DNA 损伤反应所必需的。当解旋酶从属途径在药理学上受到破坏时，细胞无法忍受 DNA 伤害操作者的更低部分，人为引发的工程致死可能发生在解旋酶抑制剂和专家之间，从而引发 DNA 伤害。尽管事实上，当解旋酶在 DNA 修复途径中工作时，可能会出现这种结果，该途径直接负责修复细胞与 DNA 伤害操作者呈递所造成的损伤，但情况通常并非如此。例如，与复制应激反应（例如，WRN、RECQ1）有关的解旋酶的小颗粒阻碍可能与烷基化操纵子协同进行，该操纵子呈现出阻碍叉子运动的麻烦的疮口。当细胞遇到解旋酶抑制剂和抑制 DNA 修复蛋白的加重剂时，就会发生人工引发的工程致死的另一个组成部分。随附的两个部分描述了基于细胞的测试，用于显示 WRN 解旋酶抑制剂与 DNA 伤害操纵子或 DNA 修复抑制剂的制造致死率。

结论

在这篇方法文章中，我们描述了用于区分和描述小原子解旋酶抑制剂的测试方法和方法，重点放在 WRN 解旋酶核酸酶上，该酶缺乏称为沃纳条件的单基因加速成熟混乱。该测试技术从简单的体外筛选开始，利用辐射链重定位测试来衡量混合物对解旋酶催化的 DNA 松弛的影响，然后通过使用与体外筛选不同的一小部分混合物进行基于细胞的检查来进行跟踪。该策略对于揭示本文中描述的主要人类解旋酶抑制剂是有效的。这种方法的一个余地是，可以选择一个库，其中意识到混音是有机动态的。任何状况之下，在无限大的文库上进行所有更高通量的筛选（通常荧光测定）是有重点的，即使是由大量加剧物组成的文库，其有机运动最近尚未评估。对于这种情况，可以采用适当的科学平台对先导化合物进行积极的改进，以提高化合物的强度、明确性和药理学边界。

尽管这项调查是根据我们的 WRN 解旋酶抑制剂试验集中设计的，但我们相信它提供了一些指导思想和试验方法，可以推断到许多解旋酶，特别是那些涉及 DNA 损伤反应或 DNA 修复的解旋酶。解旋酶抑制剂提供了一个选择性系统来研究其目标的原子和细胞元素，并且在更广泛的程度上，覆盖和满足 DNA 代谢途径的复杂协调。更重要的是，我们认为解旋酶是适当的小颗粒焦点，可以升级现有的恶性生长技术的敌人或开发为尚未想象的新型恢复药物。