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薄荷新18s核糖体RNA基因组序列的生物信息学分析

阿卜杜勒·纳西尔、阿德南·阿克巴尔和萨米娜·沙基尔

抽象的

核糖体 RNA (rRNA) 在所有已知生物中广泛传播并因其有用的平等性而闻名。由于异常配给的安排，对小亚基 rRNA (16-18S rRNA) 的检查可以对广泛范围的系统发育联系进行精确的事实估计。沿着这些思路，我们从 7 种野生治疗植物（Ferocactus glaucescens、Capparis decidua、Calatropis procera、Maytenus royleana、Prosopis Juliflora、Ficus carica 和 Mentha spicata）和 3 种发育植物（Cyamopsis tetragonoloba）中识别出 18S rRNA 质量的新亚型并进行了一半测序、 Eruca sativa 和 Solanum lycopersicum）。利用生物信息学设备对这些不同植物的18S rRNA的基因组排列进行了解剖和确认，并将其提交给基因库。我们利用 ClustalW 将这些新分组与其他已知的 18S rRNA 序列进行配对排列，以发现它们的系统发育联系。我们的结果表明，18S rRNA 的异常保存特性与可变区域可能是一些真实迹象的标志。rRNA 的选择性结构有时会影响他们对系统发育的理解。这些史诗般的 18S rRNA 群在未来的研究中在给定植物物种中的稳定表达得到确切批准后，也可以用作一些亚原子研究的内部对照，因为人们很少考虑野生植物的这些管家特性。留兰香 (Mentha spicata) 是一种药用植物，属于唇形科植物，用于治疗发烧、支气管炎、寒战、痉挛、慢性胃炎和碱性病毒。

介绍

最近的一些研究以及原子证实令人震惊地提高了我们对植物系统发育的理解（Shinwari 和 Shinwari，2010）。尽管如此，尽管一切仍然混乱，但许多重要的陆地植物群落中存在着一些变革性的联系，并且可以通过对一些有趣的管家特性进行系统发育研究来进一步研究（Shinwari 等人，2011）。管家品质是细胞消化的基本组成部分。我们必须在其他地方寻找额外的、新颖的品质来扩展当前植物系统发育的形象。核糖体 RNA (rRNA) 经常被用来重建植物转化历史的重要部分。小亚基（16S、18S）rRNA 序列被用于推测存在历史的一些努力中（Woese 和 George，1977；Woese，1987；奥尔森和沃斯，1996；沃斯，1998）。过去，18S rRNA 序列检查被用来预测早期真核生物的进化（Bhattacharya 和 Medlin，1995），并根据这些预测，将生长放入生物的姐妹群体中（Wainright 等，1993）。同样，18S rRNA 排列已被有效地用于将真核系统发育重建为许多植物集合，包括绿色植物、苔藓植物、裸子植物和被子植物（Buchheim 和 Chapman，1991；Chaw 等，1993；Chaw 等，1995；Hedderson）等人，1996 年；Chaw 等人，1997 年；Soltis 等人，1997 年；Chapman 等人，1998 年；Hedderson 等人，1998 年）。同样，一些不同的检查证明了植物的形态和生理特征（Mumtaz 等，2011）。原子多态性和系统发育联系也得到了广泛的考虑（Akbar 等人，2011）。18S rRNA 排列已被用于一些研究，主要围绕陆地植物的起源及其进入特定系统发育群体的情况（Mishler 等，1994；Hedderson 等，1996；Hedderson 等，1998）。这些研究确实描述了陆地植物在众多进化支中的联系的新例子，但由于分类单元的采样有限，在大多数情况下无法给出几乎任何植物系统发育的精确通用蓝图（Hedderson et al., 1996），这可以提示在重要血统的联系上存在一些差异。更大规模的检测可以改善依赖 18S rRNA 或相关分组的植物系统发育的推测。这似乎是一项困难的活动，因为已知基因组/质量演替的数量固定，涵盖了广泛的植物范围。遗憾的是，大部分可获取的基因组数据仍然局限于模型植物，几乎没有任何收获，也很少考虑具有相当大的经济意义和治疗质量的野生或一些发达植物（Shinwari 和 Qaisar，2011）。根据他们的外表水平将这些群体聚集成功利主义群体是有用的，因为它可以提供一个必要的系统来协调进一步的研究，以在发展中的质量项目类型中描述他们的特定工作。18S rRNA 具有管家性质 (HKG)，在所有组织和细胞类型中普遍传播，用于维持活细胞中的基本细胞能力。而且，在所有生态或探索条件下，这些品质的声明被认为是相对一致或几乎稳定的。最常用的植物管家质量是β-肌动蛋白（ACT）、α-微管蛋白（TUA）、泛素（UBQ）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、18S或6S核糖体RNA和拉伸因子（EF）等……（Nicot 等人，2005 年；Hu 等人，2009 年；Garg 等人，2010 年；Maroufi 等人，2010 年）。2010；Maroufi 等人，2010）。2010；Maroufi 等人，2010）。

在一些原子清晰度测试中，需要对 HKG 的客观质量清晰度进行标准化，以最大限度地减少目标质量测量的变化，无论试验条件如何。无论如何，在给定条件下准确选择具有稳定关节的管家质量对于实现上述目标至关重要（Jain 等，2006；Majerowicz 等，2011；Borges 等，2012）。另一方面，至少两个内务质量同样可以用作信息标准化的内部控制，以限制测试错误（Thellin 等，1999；Vandesompele 等，2002）。同样，大部分内部控制质量可识别的证据和批准检查仍仅限于展示植物或收成。正在进行的研究表明，独特的试验条件可以影响一些内部对照的稳定表达，因为它们与各种细胞标记/屏障途径相关（Vandesompele 等，2002：Sitwat 等，2012）。认识非模式植物物种已知管家品质的新同源物或直系同源物，以考虑其生存空间或探索条件所表明的代谢途径和相关品种是极其重要的。本文致力于从各种植物中识别、继承和描述 18S rRNA 特性的新同源物和直系同源物，包括七种野生恢复植物（Ferocactus glaucescens、Capparis decidua、Calatropis procera、Maytenus royleana、Prosopis juliflora、Ficus carica 和 Mentha spicata）以及三种已开发的植物（Cyamopsis tetragonoloba、Eruca sativa 和 Solanum lycopersicum），以描述它们基于 18S rRNA 排列的系统发育联系。因为我们必须调查非模型工厂的广泛内务管理质量，以将其用作内部控制质量（参考质量）。这些史诗般的、不完整的 18S rRNA 质量序列，仅限于上述植物，同样可以在给定试验条件下精确批准其可靠表达（特别是植物物种）后，用作这些选定植物的多种质量表达研究标准化的内部控制在未来。因为我们必须调查非模型工厂的广泛内务管理质量，以将其用作内部控制质量（参考质量）。这些史诗般的、不完整的 18S rRNA 质量序列，仅限于上述植物，同样可以在给定试验条件下精确批准其可靠表达（特别是植物物种）后，用作这些选定植物的多种质量表达研究标准化的内部控制在未来。因为我们必须调查非模型工厂的广泛内务管理质量，以将其用作内部控制质量（参考质量）。这些史诗般的、不完整的 18S rRNA 质量序列，仅限于上述植物，同样可以在给定试验条件下精确批准其可靠表达（特别是植物物种）后，用作这些选定植物的多种质量表达研究标准化的内部控制在未来。

材料和方法

植物材料：在这里，我们使用了十种不同的植物来区分 18S rRNA 质量的不同同源物的证据和测序，如下所示，以其经济和治疗质量。果蝇通常被称为瓜尔豆或群豆，在豆科中占有一席之地。旱季开放性作物，常在年降水量200-600毫米的极度干旱、半干旱地区生长。瓜尔豆可用作人类利用的蔬菜，也可用作奶牛饲料和绿色堆肥。它含有巨大的胚乳，其中含有大量的半乳甘露聚糖胶，可在冷水中形成浓稠的凝胶。得到的胶质是植物本质上有吸引力的结果。特别精制的瓜尔胶用作奶酪的稳定剂、冷冻酸奶的硬化剂，并且是肉的覆盖物，而评价较低的瓜尔胶则用于材料和造纸企业（Undersander 等，1991）。Eruca sativa 通常称为 taramira，属于十字花科，并被用作人类利用的果皮和蔬菜。这对于一些常规药物和治疗的安排具有重要意义（Flanders and Karim，1985）。它同样以旱季阻塞和盐恢复能力而闻名（Shannon 和 Grieve，1999）。

牛角瓜在萝藦科中占有一席之地，因其治疗特性而具有重要意义。它的各个部分被认为具有预防癌症、缓解疼痛和减轻疼痛的特性。它具有杀菌和杀虫作用，可用于治疗疾病和象皮病（Sing 等，2002）。它的乳胶被认为是治疗同时存在的污染、疾病、恶化、皮肤炎症、疟疾和二流发烧的有效解决方案（Kumar 和 Basu，1994）。它是一种旱季安全且耐盐的植物。

Capparis decidua是Capparaceae 科的个体。天然产品（绿色浆果）可用作蔬菜，并且对糖尿病活动具有不利作用。树皮被认为是治疗咳嗽、刺激和哮喘的药物。根有助于退热，芽可消泡。叶子可以用作花边，并且对治疗心脏问题很有用。芽经常被用作抗生育补品。根皮可用作驱虫剂和泻药，木煤可有效治疗固体伤口。它对持续的干旱条件特别宽容，并以其对极度干燥条件的调节而闻名。

黑花鸢尾草与含羞草科有一席之地。它是一种豆科、持久的呼吸植物。它生长在炎热干燥的地区，气温高达48°C，年降水量为150-750毫米（Darke，1993；Geilfus，1994）。它的单位是古代人类已知的最准时的食物之一。箱子经过陈酿以酿造葡萄酒。叶子可用作腐食剂。木材可用于地板、家具和许多物品。烤种子可以添加到浓缩咖啡中。树胶用作乳化剂。口香糖用于糖果。根部还含有 6-7% 的单宁，会削弱根瘤菌的功能。它被用作治疗感冒、粘膜炎、肠松弛、腹泻、眼睛、症状、刺痛、麻疹、胃痛、喉咙痛和伤口的解决方案（Duke 和 Wain，1981）。

Maytenus royleana与卫矛科 (Celasteraceae) 有一席之地。它是一种异常开放的旱季植物，可以在干燥/半干旱地区生长。粉末状结构的树皮或叶子用于家庭种植治疗骨折（Rauf 等人，2012）。无花果为双子叶植物，属于桑科植物。它是雌雄同株的落叶乔木或巨大的灌木丛。正常的无花果植物被用作利尿剂、祛痰剂、润肤剂和止痛剂。它通常用于与番泻叶和驱风剂混合的泻药糖浆中。天然产物可用作感冒药。新的无花果可用于治疗气泡和极小的肿瘤。其茎叶分离出的白色光滑汁液可用于驱除痣。

留兰香( Mentha spicata )为唇形科(Lamiaceae)草本、根茎、持久植物。它的叶子产生一种基础油，用于糖果、口香糖、冷冻酸奶和饮料的调味。它还在经济上用于购买清洁用品（牙膏、漱口水等）。由于其具有止吐、解痉、清洁、驱风、利尿、治疗、兴奋、健胃和滋补的作用，它已在许多地区被用作选择性药物。用叶子生产的恢复性香料茶可用于治疗发烧、支气管炎、发冷、痉挛、慢性胃炎、普通感冒、利尿、晨起病、鼻塞、口臭、恶心、月经不调和许多小问题。

基因组DNA提取：通过 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）技术从所有选定植物的叶子中提取基因组 DNA（Richards，1997）。收集植物叶子 (~0.3 g)，用 70% 乙醇洗涤，并在预热 (65°C) 2X CTAB 支持物中匀浆，然后在 65°C 下孵化 45 分钟，并在 10,000 rpm 下离心 10 分钟。然后收集上清液并转移到新的圆筒中。加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)并与上清液混合，然后以10,000rpm离心10分钟。将等体积的冷冻异丙醇和1M乙酸钠衍生物添加到上清液中。将混合物在 - 20°C 下保持 30 分钟以进行 DNA 沉淀。最后12点离心，000 rpm 10 分钟，进行洗涤以排除污染影响，然后风干。将沉淀重悬于 40μl 含有 10μg/μl RNase 的 Tris EDTA 缓冲垫中。DNA 测试在 37°C 下孵育 30 分钟，以消除 RNA 污染影响，并将精制样品存放在 - 20°C 下以供额外使用。DNA 测试使用 NanoDrop-1000 分光光度计（ND/-1000 V3.7.1，Thermoscientific）进行评估，并且 DNA 测试被削弱至最后集中 200ng/μl，以进行额外的亚原子研究。相应地，还通过在用溴化乙锭重新染色的1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳的堆叠测试来检查DNA测试。DNA 测试在 37°C 下孵育 30 分钟，以消除 RNA 污染影响，并将精制样品存放在 - 20°C 下以供额外使用。DNA 测试使用 NanoDrop-1000 分光光度计（ND/-1000 V3.7.1，Thermoscientific）进行评估，并且 DNA 测试被削弱至最后集中 200ng/μl，以进行额外的亚原子研究。相应地，还通过在用溴化乙锭重新染色的1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳的堆叠测试来检查DNA测试。DNA 测试在 37°C 下孵育 30 分钟，以消除 RNA 污染影响，并将精制样品存放在 - 20°C 下以供额外使用。DNA 测试使用 NanoDrop-1000 分光光度计（ND/-1000 V3.7.1，Thermoscientific）进行评估，并且 DNA 测试被削弱至最后集中 200ng/μl，以进行额外的亚原子研究。相应地，还通过在用溴化乙锭重新染色的1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳的堆叠测试来检查DNA测试。Thermoscientific）和 DNA 测试被削弱至最后的集中度 200ng/μl，以进行额外的亚原子研究。相应地，还通过在用溴化乙锭重新染色的1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳的堆叠测试来检查DNA测试。Thermoscientific）和 DNA 测试被削弱至最后的集中度 200ng/μl，以进行额外的亚原子研究。相应地，还通过在用溴化乙锭重新染色的1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳的堆叠测试来检查DNA测试。

聚合酶链式反应 (PCR)：按照生产商的说明，利用质量显性基础（Haq 等人，2010）和 Promega 的主混合物（目录号 M7502）进行 PCR，以强化上述所选植物整体的 18s rRNA 质量遵循以下 PCR 条件的指南以进行增强。第一次变性在 95°C 下进行 5 分钟，随后进行 35 个循环，在 94°C 下变性 45 秒，在 55°C 下强化 1 分钟，然后在 72°C 下扩增 1 分钟。最后一次增强在 72°C 下完成 10 分钟。 C. PCR 项目在 1% 琼脂糖凝胶上进行观察。

部分 18s rRNA 基因的测序：按照生产商的说明，使用 Axygen 制备包（目录号 AP-PCR-250）清洁测序 PCR 项目。利用 Beckman CEQ 8800 测序仪进行测序。按照提供商的建议，通过包含 RRv3.1 ace 混合物来制作测序 PCR 响应混合物。测序 PCR 通过在 95°C 下变性 1 分钟，随后在 95°C 下变性 30 种模式，在 55°C (18srRNA) 下回火各 30 秒，在 72°C 下扩增 4 分钟，随后通过72°C 明确增强 10 分钟。

序列分析：首先利用BioEdit编程检查分组。为了确认独特的分数 18S rRNA 质量排列，我们之前使用 BLAST 和“某种程度的比较演替 (blastn)”选项来发现这些质量与其他已知植物质量的相似之处。此时，从 NCBI 下载了一些其他具有较高亲缘性的植物品质，数量不断增加，并利用 BioEdit 编程进行排列，然后开发启发式吝啬系统发育树以进行转化研究。

结果与讨论

从七种不同的野生植物（Ferocactus glaucescens、Capparis decidua、Calatropis procera、Maytenus royleana、Prosopis Juliflora、Ficus carica 和 Mentha spicata）和三种发达植物（Cyamopsis tetragonoloba、芥菜和番茄）。为了对 18S rRNA 质量进行 ID 和表征，我们利用 CTAB 策略从上述植物整体的叶子中分离出基因组 DNA（Richards，1997）。高质量的基因组 DNA 是 PCR 和其他基于 PCR 的进步所必需的要素之一。提取的 DNA 的质量和数量还通过 NanoDrop (ND/ - 1000 V3.7.1) 和琼脂糖凝胶电泳进行了检查，这表明在每种情况下都接近高亚原子量 DNA，且降解最少。所有选定植物的这些基因组 DNA 都被用作聚合酶链反应 (PCR) 的格式，通过利用质量显性基础来分别提高 18SrRNA 质量。如图 1 所示，每个选定植物物种的大约 200 至 290bp 项目得到强化，如果出现非布局控制，则不出现 18SrRNA 质量的增强结果，这表明在每种情况下，PCR 中的质量显着强化。形式。我们分别对整个项目和 F.glaucescens、S.lycopersicum、C.decidua、C.procera、C. tetragonoloba、E. sativa、M.royleana、P.juliflora、F.carica 的 18S rRNA 质量分数分组进行了测序。 M.spicata在开始BLAST调查后提交至（基因库分别增加编号JX444499-JX444508），这表明与最近从 NCBI 数据库下载的植物 18S rRNA 质量同源物有很大程度的相似性。我们的结果证实，所有测序项目都是与非模式植物物种分离的 18S rRNA 质量的特殊且新颖的序列。  

为了发现最近从前面提到的植物中分离出来的 18S rRNA 特性的相似性和定量实例，我们调整了这些新的中间分组以及其他植物物种明确已知的 18SrRNA 特性，如图 2 所示。我们的信息建议该特定部分在这些选定的植物物种中，约 200-290 bp 的 18S rRNA 受到特别监测。与几乎没有出现严重波动的序列相比，这些分组中的大部分具有较少的因素安排。引人注目的是，我们无法感知到任何显着的对比或单子叶植物或双子叶植物正常的一种适度的区域。

为了发现最近限制的 18S rRNA 特性的中间序列之间的相似性和保存的例子，我们调整了这些新颖的不完整排列以及其他植物物种明确已知的 18SrRNA 特性，如图 2 所示。我们的信息表明，这个特定片段约 200在这些选定的植物物种中，-290 bp 的 18S rRNA 特别保存。与不同的安排相比，这些分组中的很大一部分没有那么不稳定。奇怪的是，我们无法察觉到单子叶植物或双子叶植物正常的任何显着对比或新颖的保留区域。同样，利用所有上述 18SrRNA 分数排列额外构建了系统发育树，如图 3 所示。我们的结果表明，所有选定植物的 18SrRNA 质量都得到了严重程度的保存。对 18S rRNA 实例的检查和被子植物的进展完全或部分支持了表明过去研究中的变化和颠换的进化枝。我们的信息表明，这些选定的植物分为三个重要的分支。一个重要的进化枝包含 14 个植物种，包括 E. sativa、B.oleracea、A.thaliana、O.sativa、C.decidua、H.orientalis 等。

随后的进化枝聚集了四种选定的植物物种（S. indicum、C. caesius、S. lycopersecum、T. angustifolia）。引导评价是该特定分支的确定性水平的特征。第三个进化枝是 M. spicata 的姐妹，包含除 C. procera 之外的其余植物，C. procera 是树中的不同分支。任何单一物种或分支的异常位置可能偶尔会由一种或多种不同的植物物种发生，这些植物物种要么包含分组错误，要么没有附近的科成员。从上述调查中收集到的这些联系并不像引导程序检查最近估计的那样完全得到支持。尽管树的整体模式完全可以通过已实现的陆地植物系统发育来预测（Crane，1985；Kenrick 和 Crane，1997）。尽管越来越多的解释表明，这种依赖于 18S rRNA 分组的植物系统发育研究仍然需要进行检查，因为这种检查并不能清楚地解决这些植物的基本联系，因为这些排列之间的保存程度很高。果断地，我们的信息表明，在该特定区域中，这些最近分离的该选定植物群的 18S rRNA 质量的不完整分组的保存水平有所提高。这个 18S rRNA 质量的保留区域可能太不变，甚至无法考虑显示足够的系统发育标志来发现这些植物之间的联系。此外，在这个管制区可能需要一定数量的品种，并且由于这些目的地的不同替代品，标志被同质化所掩盖。以这种方式，仅对几乎任何分类单元的 18S rRNA 中途分组进行研究可能会产生并非到处都定居和支持的树木。尽管如此，这些安排与其他安排相结合可能会提高目标和内部帮助（Soltis 等，1998）。我们同样建议测试这些新颖的 18S rRNA 质量，以便在未来获得适当批准后，将其用于客观质量清晰度读数，以实现清晰度信息的标准化。

致谢

这项研究得到了巴基斯坦高等教育委员会 (grant#1212) 向巴基斯坦 Quaid-eAzam 大学 SNS 的支持。