益生菌与健康杂志
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通过荧光染色和荧光显微镜观察益生菌嗜酸乳杆菌的细胞壁完整性和原生质体形成

瑞恩·佩吉、大卫·伯克、卡亚努什·阿雅纳

细菌细胞原生质体的鉴定以前使用相差显微镜。该方法通过原生质体的大小和形状变化来确定原生质体。可以使用一种更可验证的方法，利用针对特定细胞成分的荧光染色剂。本研究的目的是利用荧光显微镜技术来确定益生菌嗜酸乳杆菌中是否存在细菌细胞壁，接触细胞壁消化酶后。用不同浓度的溶菌酶 [0、175、250、425 μg/ml] 处理细菌细胞，并在 37°C 下孵育 10 分钟。溶菌酶处理后的细胞用不同浓度（1x、2x、10x 和 100x）的两种荧光染料（小麦胚芽凝集素 (WGA) 和 Hoechst 33342）进行荧光染色。WGA [CF ^®594 WGA（一种红色荧光染料）用于选择性结合细胞壁肽聚糖层的残基，Hoechst 33342（一种蓝色荧光染料）用于特异性结合细菌细胞双链DNA的核酸。遵循荧光显微镜样品制备的标准方法。对每种溶菌酶和染色剂组合研究了三个区域。进行单向方差分析以确定溶菌酶浓度的差异。p 值 < 0.05 被认为有显着差异。溶菌酶浓度为 175 和 250 μg/ml 时细胞壁结构完整性开始恶化，浓度为 425 μg/ml 时细胞裂解和 DNA 条纹增加。175 μg/ml 的溶菌酶浓度平均产生 41% 的原生质体或部分消化细胞壁。溶菌酶浓度从 175 μg/ml 增加到 250 μg/ml 导致原生质体平均百分比下降 (4%)。当浓度为 425 μg/ml 时，原生质体的平均百分比下降至 1%，同时 DNA 条纹也有所增加。在 1 倍染料浓度下，观察到细胞壁的部分染色。2 倍时，记录细胞壁的完整染色。在 10 倍倍数下，观察到细胞壁和细胞核的完全染色，与 2 倍倍数下的染料浓度相似，但染料没有明显饱和。100 倍的染料浓度会导致细胞壁和细胞核中的染料过饱和，导致它们混合并抑制识别细菌细胞和原生质体的功效。2x 最适合细胞壁和细胞核的完整染色。随着染料浓度的增加，观察到背景荧光噪声。在嗜酸乳杆菌，溶菌酶浓度为 175 μg/ml 足以消化细胞壁。染料浓度在 2 倍时效果最佳，且背景噪音最少。