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国际标准期刊号: 2090-4924
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纳塔利娅·贝尔纳迪·维代拉
抽象的过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARδ）与炎症、肥胖、血脂异常、糖尿病、癌症和心血管疾病等病理生理过程有关，被认为是这些过程的新治疗靶点。在这里，我们开发并建立了一种筛选方法来驱动 PPARδ 激动剂。我们使用能够从化合物库中识别新分子的方法，这些新分子可以作为该受体的配体。该筛选流程的第一步是有效的细胞反式激活测定，作为潜在化合物的初步搜索。我们开发了一种基于细胞反式激活报告基因技术的检测方法，在自动移液器的支持下在 96 孔微孔板上进行。所应用的验证方法是热位移测定的组合，用于检查反式激活测定中选择的化合物或提取物成分是否稳定PPARδ三级结构；结合 ANS 猝灭测定，检查化合物是否与 PPARδ 的疏水性配体结合袋结合。此外，通过Z因子评估细胞高通量筛选（HTS）的稳定性和可靠性质量，并使用天然提取物库来验证所开发的方法。结果表明，我们开发了一种能够搜索可行且足够稳健的化合物或提取物的管道，以测量 PPARδ 激活、三级结构稳定性和配体结合。例如，我们可以找到一种含有有趣分子的植物提取物，能够结合并激活 PPARδ。综上所述，与单一激活筛选相比，该流程表现出更高的功效，因为它可以排除可能促进间接 PPARδ 激活的假阳性，而无需与受体发生物理相互作用。最后，这种方法可以提高药物开发中筛选 PPARδ 激动剂的有效性。
介绍
过氧化物酶体增殖物激活受体 β/δ (PPARß/δ) 是一种脂质驱动记录因子，它是原子受体 (NR) 超家族的一个个体，可指导一些客观特征的启动或抑制。PPARß/δ 在人类中普遍存在，尽管它主要存在于皮肤、胎盘、大脑、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪骨骼肌和胃相关气缸中。
PPARß/δ 与一些代谢途径相关，例如能量消化、体内平衡、脂肪生成和脂质消化。一些研究表明，激动剂对 PPARß/δ 的调节可影响食物摄入、体重、胰岛素敏感性、肥胖和体重。它还与不同的病理生理学形式有关，例如刺激、肥胖、血脂异常、糖尿病、恶性肿瘤和心血管疾病。PPARß/δ 还具有额外代谢功能，包括针对多种硬化症、中风、阿尔茨海默病和帕金森病等精神疾病的神经保护作用，并在细胞分离和增殖、免疫指南、氧化压力和皮肤科学中发挥作用。
PPARß/δ 工作的良好多样性已被确定为具有在其配体限制区 (LBD) 中约束和束缚各种配体的能力，具有广泛的常规配体和工程配体。常规配体包括不饱和脂肪、前列腺素和白三烯。一些高度偏爱和亚型明确的 PPARß/δ 激动剂已被创建并提交用于治疗代谢疾病的临床初步研究；无论如何，还没有配体可供临床使用。
由于大量个体受到 PPARß/δ 相关问题的影响，因此开发明确的配体来调节受体的作用具有令人难以置信的意义。在这里，我们创建并建立了一个合理、成本较低且强大的筛选流程，以更好地识别 PPARß/δ 激动剂的证据。在该管道的第一步中，我们将基于细胞的反式激活措施缩短了 1 至 2 天，并且使用的试剂比最近描述的要少，从根本上减少了巨大筛选工作的时间和现金费用。此外，我们还了解了两种避免虚假阳性结果的批准方法：热移动测试 (TSA)，用于检查热门竞争对手的 PPARß/δ 三级结构调整，显示对蛋白质的直接权威，
到目前为止，大多数 PPAR 筛选策略明显依赖于反式激活测试，这是衡量原子受体作用最广泛认可和根深蒂固的惯例。尽管如此，该策略可能允许选择虚假的阳性加剧物，从而在没有激动剂特性的情况下以反手路径驱动 PPARß/δ。为了克服这个漏洞，我们提出了一个管道，其中反式激活措施通过生物物理检查进行跟踪，以确认该化合物与 PPARß/δ 配体袋合法结合。
特别是，我们的流程与其他提出的 PPARß/δ 反式激活策略的显着差异是测试长度和体积的减少；细胞转运蛋白；电脑化；以及生物物理批准技术的扩展。此外，该管道还通过明确的 PPARß/δ 激动剂（GW0742、GW501516 和 L-165,041）和 - 因子进行了评估。总而言之，我们建议该管道是一种稳定、更便宜、更快速、更强大的工具来区分 PPARß/δ 激动剂，此外，我们还针对所创建的管道尝试了特征项目库。
讨论
我们研究的目的是概述一个通过更快、更便宜的反式激活基本筛选来观察和描述 PPARß/δ 激动剂的管道，并采用两种生物物理技术，旨在避免假阳性并选择直接结合和启动 PPARß 的颗粒或浓缩物/δ。
决定将细胞反式激活记者质量测试作为该管道的初始阶段，使筛选能够从日益生理的角度开始。对于这种情况，所选择的颗粒或浓缩物必须使细胞层饱和，找到并结合受体，并促进其激活。尽管已经提出了不同的策略，例如 TSA、ANS 和 FRET 来评估 NR 配体官方，但我们认为反式激活措施可以在短时间内产生定量和有用的数据，这使其成为最适用和最重要的检查之一用于应用于 NR 的化合物筛选和药物披露。在此期间，尽管体外 FRET 对于商业包的设置要求最低，但它与细胞条件不相符。ANS 荧光熄灭同样更便宜；考虑到所有因素，HTS 筛查不仅是一种体外方法，而且非常艰巨且耗时。此外，尽管 TSA 旨在应用于配体筛选，但它没有考虑常规浓缩物的固有荧光或 PPARß/δ LBD 的高疏水性，这可能会干扰荧光信号。总而言之，TSA、ANS 和 FRET 都具有生物物理测量的缺点，因为它们通常与体内研究不太相符。它没有考虑常规浓缩物的固有荧光或 PPARß/δ LBD 的高疏水性，这可能会干扰荧光信号。总而言之，TSA、ANS 和 FRET 都具有生物物理测量的缺点，因为它们通常与体内研究不太相符。它没有考虑常规浓缩物的固有荧光或 PPARß/δ LBD 的高疏水性，这可能会干扰荧光信号。总而言之，TSA、ANS 和 FRET 都具有生物物理测量的缺点，因为它们通常与体内研究不太相符。
总之，我们认为细胞培养中的反式激活记者质量检查是最相似的测试，因为它们滥用了 NR 的常规标记途径；当配体添加到框架中时，受体被激活，从而产生柱蛋白，这是可以估计的。通过这种方式，生物物理技术可以而且应该被用作筛选流程的额外步骤，因为它们为命中描述提供了重要数据，例如直接限制性确认（TSA）和分离一致性评估（ANS 和 TSA）。与 FRET 和 Lantha-Screen（可能被认为比商业包便宜）相关，这些选择的批准策略存在给出迂回结果共激活剂估计的缺点。