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基因工程 Cyt b5-CYP3A4 融合蛋白与 POR 在 Sf9 昆虫细胞中的共表达及表达产物的体外功能表征

谢章明、Shabbir Ahmed、刘文辉、孔思思、徐迎春、刘婷和陈淑清

人细胞色素P450 3A4（CYP3A4）是肝脏中最丰富的I相药物代谢酶，市场上大约50%的药物是通过CYP3A4代谢的。因此，许多体外研究依赖重组 CYP3A4 作为筛选工具来评估体内潜在的药物相互作用 (DDI)。然而，有关具有高催化活性的重组 CYP3A4 的信息有限。因此，本研究旨在获得具有高催化活性的重组CYP3A4并在体外表征其功能。为了增强异源表达的CYP3A4的催化活性，将该酶与细胞色素b5（b5）尾对头融合，并将融合酶与NADPH-P450还原酶（POR）一起插入单个质粒中以实现同时表达在 sf9 细胞中。在这里，底物结合亲和力，研究了融合酶的酶活性和体外 DDI 中的应用。POR-cyt b5CYP3A4的解离常数Kd为8.3±0.87 μmol/L，POR-cyt b5CYP3A4在睾酮代谢中的Clint(Clint=Vmax/Km)为8.57 mL/min/g蛋白质，150.3 mL/min/ g 蛋白为咪达唑仑。此外，酮康唑对睾酮代谢的抑制常数Ki为0.013±0.0038μmol/L。目前的结果表明融合酶的底物结合亲和力和酶活性显着增加。因此，该构建体可能有助于体外研究与 CYP3A4 相关的药物代谢和 DDI 研究。此外，融合酶和 POR 的同时表达可以基于更稳定的 CYP3A4/POR/b5 摩尔比提供更具重复性的结果。