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国际标准期刊号: 2090-4924
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泽拉·塔特利、马修·德里萨和埃达·塞利克
抽象的
低成本、pH值和热稳定的纤维素酶化合物是工业化生产生物乙醇的重要因素，而生物乙醇是可持续的活力源泉。如今，纤维素酶的费用占乙醇生产绝对成本的 40-50%，并且为了提高业务效率，纤维素酶的费用有望降低 5 倍。与玉米和糖棒等食品原料不同，通过内切葡聚糖酶（纤维素酶）从纤维素生物质中获取乙醇将降低生产成本。在此过程中，宿主细胞的决定至关重要，以便逐渐生长保守的创造形式。大肠杆菌细菌是最受青睐的重组蛋白产生宿主之一。然而，众所周知，与真核细胞相比，在细菌框架中传递的化学物质更加实用，因为它们可以大量释放。在这种特定情况下，截至最近，密码子增强的新型 Cel5A 化合物在大肠杆菌的细胞内和细胞外进行通讯蛋白质印迹和分光光度蛋白质运动测试对生物过程进展测试进行了跟踪。我们将细胞内化合物运动 50 折痕扩大至 0.74 IU/mL，将细胞外蛋白质作用 5 重叠扩大至 1.5 IU/mL。本研究中创建的重组纤维素酶催化剂和生物工艺对于克服生物燃料和活力领域的瓶颈具有重要意义。
革兰氏阴性细菌大肠杆菌已被广泛用作细胞加工厂，用于制造蛋白质，并因合成混合物而闻名，因为它是具有许多可访问的表达和指导框架的最佳描述的宿主。尽管如此，大肠杆菌中传递的重组蛋白通常存在于细胞内，并且经常作为考虑体被发现。细胞外产生的蛋白质与细胞内产生的蛋白质相比是非常有价值的，因为细胞外蛋白质可以更有效地被清洁，并且可以免受蛋白酶的攻击，从而带来更高的产品质量。在这次检查中，我们发现纤维素酶 (Cel-CD) 的增效剂区域及其 N 端可用作细胞外重组蛋白产生的转运蛋白。
介绍
革兰氏阴性细菌大肠杆菌通常被用作细胞制造工厂，用于生产化合物和恢复性蛋白质，因为它是描述最好的宿主，具有许多可用的连接和引导装置。无论如何，基础研究设施的大肠杆菌菌株在普通培养条件下只能无助地分泌蛋白质，因为这种细菌有一个令人难以置信的两层细胞膜。这样，重组大肠杆菌中产生的异源蛋白通常位于细胞内，并且通常作为掺入体，必须通过复杂且昂贵的程序从中回收天然动态蛋白。在大肠杆菌中胞外产生异源蛋白质不仅会提供基本且有用的创造和精炼过程，
在大肠杆菌中向胞外递送靶蛋白的关键努力已经做出，探索工作分为两类。(1)利用先锋肽，例如PelB，通过内层(IM)将异源蛋白靶向聚集在周质空间中，此时异源蛋白利用细胞通过外膜(OM)排出到培养基中包膜怪胎或裂解蛋白；(2)异源蛋白质与组合共犯的融合，其可以通过已知或模糊的框架从胞质溶胶发射出电话。
各种标志肽已被用于在真核生物和原核生物中分泌产生重组蛋白。常见的信号排列通常位于蛋白质的氨基末端，起到聚焦和应答信号的作用，并含有一个切割位点，在运输后可以被特殊的信号肽酶切断。无论如何，由于大肠杆菌的双层结构，与信号分组结合的重组蛋白被移动到周质空间而不是培养基。为了将目标蛋白释放到生命培养基中，使用了细胞包膜怪胎或裂解蛋白。但由于细胞膜的破裂，它还经历了排出的蛋白质的纯净和细胞对地球的影响。
关于后续方法的利用，一些蛋白质，包括异源蛋白质，被认为是从重组大肠杆菌合法地释放到培养基中的。尽管如此，仅研究了几种蛋白质作为细胞外重组蛋白质产生的组合物，因为其发射效率和包容性不足以扩展到更大的表达量。2005年，Majander等人改变了大肠杆菌的鞭毛III型放电机械组件。此时，通过将优质 fliC（编码鞭毛蛋白）上游的 173 bp 非翻译区之间的异源蛋白与来自 fliC 的转录消除子结合起来，他们发现目标蛋白质可以通过 III 类排放装置以 1 至 15 mg/L 的水平排放到培养基中。因此，科学家们在大肠杆菌中发现了一种 13 kDa 的内源性细菌肽 YebF，它可以通过周质空间的二次过程将其大量释放到培养基中。最近，利用蛋白质组学技术区分了来自大肠杆菌 BL21 (DE3) 的渗透诱导蛋白 Y (OsmY)。OsmY 同样可以在浓度范围为 5 至 64 mg/L 的目标蛋白处从细胞中排出。此外，瓦克获得许可的排放框架ESETEC®是一项在受保护的大肠杆菌K12菌株上制造蛋白质和反作用剂片段的创新技术，也是我们见解的唯一商业答案。科学家们在大肠杆菌中发现了一种 13 kDa 的内源性细菌肽 YebF，它可以通过周质空间的两次预加工将大量的肽释放到培养基中。最近，利用蛋白质组学技术区分了来自大肠杆菌 BL21 (DE3) 的渗透诱导蛋白 Y (OsmY)。OsmY 同样可以在浓度范围为 5 至 64 mg/L 的目标蛋白处从细胞中排出。此外，瓦克获得许可的排放框架ESETEC®是一项在受保护的大肠杆菌K12菌株上制造蛋白质和反作用剂片段的创新技术，也是我们见解的唯一商业答案。科学家们在大肠杆菌中发现了一种 13 kDa 的内源性细菌肽 YebF，它可以通过周质空间的两次预加工将大量的肽释放到培养基中。最近，利用蛋白质组学技术区分了来自大肠杆菌 BL21 (DE3) 的渗透诱导蛋白 Y (OsmY)。OsmY 同样可以在浓度范围为 5 至 64 mg/L 的目标蛋白处从细胞中排出。此外，瓦克获得许可的排放框架ESETEC®是一项在受保护的大肠杆菌K12菌株上制造蛋白质和反作用剂片段的创新技术，也是我们见解的唯一商业答案。其可以通过周质空间的两次推进过程以通常巨大的量排放到介质中。最近，利用蛋白质组学技术区分了来自大肠杆菌 BL21 (DE3) 的渗透诱导蛋白 Y (OsmY)。OsmY 同样可以在浓度范围为 5 至 64 mg/L 的目标蛋白处从细胞中排出。此外，瓦克获得许可的排放框架ESETEC®是一项在受保护的大肠杆菌K12菌株上制造蛋白质和反作用剂片段的创新技术，也是我们见解的唯一商业答案。其可以通过周质空间的两次推进过程以通常巨大的量排放到介质中。最近，利用蛋白质组学技术区分了来自大肠杆菌 BL21 (DE3) 的渗透诱导蛋白 Y (OsmY)。OsmY 同样可以在浓度范围为 5 至 64 mg/L 的目标蛋白处从细胞中排出。此外，瓦克获得许可的排放框架ESETEC®是一项在受保护的大肠杆菌K12菌株上制造蛋白质和反作用剂片段的创新技术，也是我们见解的唯一商业答案。OsmY 同样可以在浓度范围为 5 至 64 mg/L 的目标蛋白处从细胞中排出。此外，瓦克获得许可的排放框架ESETEC®是一项在受保护的大肠杆菌K12菌株上制造蛋白质和反作用剂片段的创新技术，也是我们见解的唯一商业答案。OsmY 同样可以在浓度范围为 5 至 64 mg/L 的目标蛋白处从细胞中排出。此外，瓦克获得许可的排放框架ESETEC®是一项在受保护的大肠杆菌K12菌株上制造蛋白质和反作用剂片段的创新技术，也是我们见解的唯一商业答案。
最重要的是，通常认为没有组合放电框架适合每种异源蛋白质，因为当前的组合共犯框架似乎存在限制。在本次检查中，我们报告称，当异源过度表达时，来自芽孢杆菌属 sp.Z-16 的纤维素酶 (Cel-CD) 的反应物区域可以有效地从大肠杆菌中释放出来。生命之道培养基中Cel-CD的收集量达到514mg/L。由于纤维素酶在纤维素生物质变化中发挥着重要作用，大肠杆菌中 Cel-CD 的胞外连接为纤维素的产生提供了一个阶段。Cel-CD 及其 N 末端分组都有可能作为创建不同重组蛋白的组合共犯。
结果
Cel-CD 中缺乏标志肽促使我们确定其亚细胞区域。使用冷渗透击晕策略对持有 Cel-CD 的大肠杆菌 BL21 (DE3) 进行分析，如材料和方法中所述。我们发现Cel-CD存在于细胞质、周质间隙和培养基中，这表明Cel-CD通过抗Cel-CD抗体的Western Blot检测是通过周质间隙发射的。在最终的测试中，我们在生命方式中添加氯霉素来抑制初期的蛋白质生物合成，并发现周质空间中的 Cel-CD 数量显示出潜在的增加，并以这种方式减少数量，尽管它在逻辑上聚集在周质空间中。中等的。这些发现表明Cel-CD的放电是一个借助周质空间的二次发射过程。
为了防止细胞外 Cel-CD 收集是由于细胞裂解或细胞通过外膜溢出而产生的可能性，我们对 Cel-CD 以及对照蛋白、周质麦芽糖限制蛋白 (MBP) 和细胞质蛋白 GroEL 进行了蛋白质印迹检查。 。培养基中对照蛋白的接近度将是细胞裂解的标志。Cel-CD在每个时间点的生命介质中都得到了区分，尽管MBP未被识别，而GroEL只是在扩展开发后的后续总结中被识别。这证明细胞外Cel-CD不是从细胞裂解中获得的。
一项正在进行的报告表明，来自 Thermobifida fusca 的异源通讯角质酶由于其向磷脂的水解运动而从细胞中释放出来。为了防止 Cel-CD 放电由其在周质空间中的水解作用额外引起的可能性，Cel-CD 的动态位点通过与纤维素酶的部分氨基腐蚀连续排列的结果进行了转化。尚未在培养基中发现两个异常现象：E160Q、E160Q 和 E274Q，其中水解作用完全丧失（图 3B）。通过透射电子显微镜 (TEM) 分析大肠杆菌 BL21 (DE3) 菌株的形态。它表明与 Cel-CD 或灭活的 Cel-CD 进行通讯的细胞保持完好无损，支持了前面提到的结果。
Cel-CD 的高产和定量释放使我们有机会测试它是否可以作为组合伴侣或信号肽/蛋白质在重组大肠杆菌中制备细胞的不同蛋白质。我们选择了一系列不同大小和来源的蛋白质，包括来自枯草芽孢杆菌的果胶酸裂合酶 C（PelC，24.3 kDa）、来自 B. subtilis 的人神经突蛋白（NRN1，15.3 kDa）、来自 B. subtilis 的环糊精糖基转移酶的糖限制空间（CBD，11.21 kDa）。 B. circulans、来自大肠杆菌的麦芽糖限制蛋白（MBP，43.4 kDa）和甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（GlpQ，40.8 kDa）。当这五种蛋白质在没有符号分组的情况下进行交流时，必须在细胞质中进行识别。当与 Cel-CD 下游缠绕在一起时，这些蛋白质中的每一种都在培养 24 小时后在培养基中被识别；尽管如此，排放水平还是有所波动。Cel-CBD 的排放量最高，达到 348 mg/L。Cel-glpQ、Cel-MBP、Cel-pelC 和 Cel-NRN1 在生命培养基中的排放量也相当可观，分别估计为 266.8、307.6、264.6 和 211.3 mg/L。
讨论
在本次研究中，我们证明了 Cel-CD（来自芽孢杆菌属 sp.Z-16 的纤维素酶的增效剂区域）在大肠杆菌 BL21 中传播时，可以将其排入生命介质中，而无需运行常规信号装置。 （DE3）。作为一种异源蛋白，Cel-CD的过表达并未发现对细胞发育和消化有任何阻碍。这可能会阻止复合体过度表达引起的细胞裂解，从而延长衰老过程以构建细胞外产物。然后，Cel-CD及其重组蛋白的释放是一个二次过程，周质的氧化条件和Dsb排列有利于二硫键的形成。进一步的研究表明，Cel-CD 也可以从大肠杆菌K株，例如大肠杆菌BW25113、MG1655，但排放程度要低很多。因此，Cel-CD组合的使用并不是菌株从属的。
我们已经证明全长 Cel-CD 的 N 末端分组在放电中发挥着关键作用。这表明 Cel-CD 的 N 端 20 个氨基腐蚀性堆积物可以作为转运蛋白填充，用于从大肠杆菌中发射异源目标蛋白。与 Cel-CD 或 N20 结合，五种选择的蛋白质被发现以显着水平释放到培养基中。排出生产率取决于目标蛋白质的特性。鉴于其在大肠杆菌中的高溶解能力和巨大的尺寸，Cel-CD 具有适合发射少量和低溶解性蛋白质的所有特征，而 N20 肽越来越适合于大量蛋白质。值得注意的是，所有释放的组合蛋白均表现出相对较高的溶解能力；溶解度低的组合蛋白不能有效排出。我们认为组合蛋白的溶解能力对于放电至关重要，而蛋白质的N端排列和三维结构是一个重要因素。将异源蛋白与来自Cel-CD的N20组合可以得到细胞的目标蛋白。这是第一份表明短肽可以作为信号肽填充并引导异源蛋白穿过细胞内膜和外膜的报告。大肠杆菌。
结论
大肠杆菌中产生的重组蛋白通常位于细胞内，并且经常作为考虑体被发现。在这项检查中，发现大肠杆菌中纤维素酶（Cel-CD）的异源连通增效剂区域随着内切β-糖苷酶的运动而大量排出细胞外。我们发现 Cel-CD 的 N 端分组在此发射中发挥了重要作用，这表明 Cel-CD 及其 N 端都可以用作重组蛋白在细胞外产生的转运蛋白。将Cel-CD的组合蛋白与不同种类的水解化合物相连接的重组大肠杆菌可用于形成固化的生物过程。