植物生物化学与生理学杂志
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烟草原生质体中CRISPR-Cas9 介导的CYP82E4-尼古丁 N-脱甲基酶 (nnd)基因编辑

安基塔·什雷斯塔 (Ankita Shrestha)、艾哈迈德·汗 (Ahamed Khan) 和尼辛哈·戴伊 (Nrisingha Dey)

单RNA引导DNA识别CRISPR-Cas9方法是一种简单而强大的靶向基因组工程工具。在这里，我们报告了有效的花椰菜病毒启动子衍生的二元载体的设计和测试，用于使用 CRISPR-Cas9-gRNA 系统进行基因组编辑。对于这种定向诱变，我们创建了二元转化载体，通过从紫茉莉花叶病毒(MMV) 中分离和表征的有效花椰菜病毒启动子“M24”来驱动 Cas9 的表达。20 核苷酸 CRISPR 引导 (g)-RNA 旨在诱导烟草 ( Nicotiana tabacum ) CYP82E4-尼古丁 N-脱甲基酶 (nnd)基因的靶向突变。用于编辑nnd基因中，我们采用了一对 gRNA，后跟针对 nnd -ORF的第一个外显子的原型间隔子相邻基序 (PAM) 。我们使用烟草原生质体细胞评估了“插入/缺失”百分比，其中两个靶标的诱变频率分别为 45% 和 30%。在烟草原生质体中同时转染两种 gRNA 后，获得了 37% 的诱变效率。我们基于花椰菜病毒的 CRISPR-Cas9-gRNA 系统的成功演示预示着其近期将成为在植物中进行靶向基因组编辑的潜在且简便的手段。