细胞科学与治疗杂志
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小鼠精子发生过程中 C-Kit 转基因构建体的设计和分子表征

Swanand Koli、Arun P Sikarwar、Murali R Babu 和 Reddy KVR

在出生后睾丸中，未分化的 A 型精原干细胞 (SSC) 在 c-Kit 存在的情况下分化为 B 型精原细胞 (SGC)，c-Kit 在哺乳动物精子发生过程中以细胞/阶段特异性方式表达。c-Kit 受到严格的转录控制，因为它不仅对生殖细胞至关重要，而且对造血干细胞和黑素细胞的发育也至关重要。尽管 c-Kit 表达是一个动态调节过程，但其在精子发生过程中转录调节的分子基础仍然大部分未明确。本研究的目的是确定将表达 c-Kit 的转基因构建体引入从 Wv/Wv 突变小鼠分离的 c-Kit 阴性 SSC 中是否会在受体小鼠的睾丸中分化和定植。为此，7. 设计了包含 4.4 kb c-Kit-ORFGFP 表达盒的 4 kb pG1-Kit-ORF-GFP 转基因构建体，并通过免疫荧光和流式细胞术分析证实了其体外表达。为了比较结果，还设计了三个对照-GFP构建体，分别具有1.1kb（缺乏c-Kit启动子和ORF）、4.1kb（缺乏c-Kit启动子）和1.4kb（缺乏c-kit-ORF）并通过电穿孔 (EP) 引入 SSC。使用生殖细胞移植（GCT）方法通过视网膜将这些SSC引入白消安治疗的受体不育小鼠的睾丸中。据观察，与对照组相比，携带 c-Kit-ORF-GFP 转基因插入物的 SSC 能够在受体小鼠的生精小管中定植并分化为其他生殖细胞谱系。综上所述，睾丸 Wv/Wv 突变小鼠具有 SSC 群体，其中 c-Kit 信号传导功能受损，这是我们首次报道通过引入 c-Kit-ORF- 可以恢复受体不育小鼠中的 SSC 功能GFP 转基因插入物。因此，目前的发现可能对理解生殖生理学和睾丸衰竭患者未来新疗法的潜力产生重大影响。