克隆与转基因
开放获取

抽象的

定向克隆法设计与重建pcDNA 3.0多克隆位点哺乳动物表达载体

希巴·纳兹、赛义德·纳基·卡齐姆

传统克隆是指我们使用限制性内切核酸酶产生具有特定互补末端序列的 DNA 片段，这些片段可以在转化之前用 DNA 连接酶连接在一起。本研究的目的是通过用其天然多克隆位点替换垃圾DNA来重建哺乳动物表达载体。质粒增殖并用 Xho1 和 Kpn1 酶消化垃圾 DNA 的两侧，从载体上切下 600 bp DNA，然后连接设计与其多个序列位点类似的 30 bp 引物。通过质粒分离、质粒菌落PCR、克隆质粒PCR、凝胶电泳与原始质粒比较以及最后测序来确认正确插入。限制性消化后，从载体中切下额外的 600 bp DNA 片段。连接的菌落出现在琼脂平板上，从中产生 60 bp 菌落 PCR 产物。克隆后进行质粒分离，并进行菌落PCR和克隆质粒PCR证实克隆。成功克隆pcDNA3.0哺乳动物表达载体中的多个克隆位点。pcDNA 载体中多个克隆位点的连接提供了各种限制性酶识别位点，可实现简单快速的克隆。