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对生物质进行酶法预处理以提高沼气产量- Giuliano Degrassi- 国际遗传工程和生物技术中心- Giuliano Degrassi- 国际遗传工程和生物技术中心

朱利亚诺·德格拉西

利用产甲烷菌通过厌氧消化从生物质和有机残渣生产沼气是可持续生产生物燃料的重要生物技术过程。该过程的限制因素之一是生物质中所含能量向沼气的转化率较低。这主要是由于消化器中存在的微生物群落对植物细胞壁成分的代谢困难，这主要是由于纤维素、半纤维素和木质素的复杂性造成的。纤维素非常丰富，其完全转化为甲烷将提高该过程的效率。多糖和其他生物聚合物生产沼气经过四个步骤：水解、产酸、产乙酸和产甲烷。显然，更有效的水解对于产生更多沼气的重要性。我们开发了三种异源表达系统，用于生产以下酶，例如来自短小芽孢杆菌的内切纤维素酶（内切葡聚糖酶）；来自黄单胞菌的纤维二糖水解酶，来自解淀粉芽孢杆菌的β-葡萄糖苷酶。已知这三种酶参与纤维素解聚，解聚分三个步骤进行：(i) 纤维素聚合物裂解和低聚物形成；(ii)从纤维素低聚物中除去二聚体（纤维二糖）；(iii)从纤维二糖二聚体中释放葡萄糖。通过 PCR 扩增编码上述酶的三个基因，克隆到 pTOPO 中，测序以验证扩增是否正确，然后克隆到 pQE（一种提供 6xHis 标记蛋白的表达载体）中。E. 表达系统为大肠杆菌M15。然后，借助六个组氨酸标签，通过一步亲和层析纯化这三种酶，并将其用于纤维素消化实验。考虑到两种酶在大肠杆菌中表达时不溶（纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶形成包涵体），因此考虑使用替代的异源表达系统（酵母毕赤酵母）来生产这些酶。该项目的最终目标是开发一种预处理方法，用于将生物质和含有纤维素的工业有机残留物转化为可通过产甲烷菌发酵生产沼气的底物。虽然毕赤酵母中的异源表达仍在开发中，我们已经拥有用于生产重组细菌内切葡聚糖酶的有效系统。已确定该酶的最佳使用条件，最适pH为6.0，最适温度为400℃。在 pH 6.0 和温度 400C 的条件下，酶在一周后仍保持 50% 的活性。该酶在一些底物上进行测试，发现能够解聚微原纤维纤维素（Sigma）、造纸工业残留的短纤维纤维素、玉米芯粉和玉米杆粉，比活性分别为251、142、75和70 IU/分别为毫克。下一步将测量经过和未经纤维素分解酶预处理的不同含纤维素有机残留物的产甲烷潜力。经过这个实验，