研究与开发杂志
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国际标准期刊号: 2311-3278
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伊戈尔·卡特科夫
抽象的
介绍：人类多能干细胞 (hPSC) 在细胞治疗和再生医学方面具有良好的潜力，并且可以作为证明体外胚胎毒性的有用工具。hPSC 的冷冻保存 (CP)、储存和运输是最终临床应用的关键要素，需要大量质量受控的多能干细胞。虽然针对常规细胞系甚至小鼠胚胎干细胞 (mESC) 的有效 CP 方案已得到很好的建立，但 hPSC 的情况并非如此，因为冷冻后活细胞和多能细胞的回收率较低，而且 hESC 生长速度缓慢，因此从解冻到获得适合实验的培养物的时间可能只有一周。
一般材料和方法：hESC-iPSC 的衍生 - 细胞在 Knockout Dulbecco 改进的 Eagle 培养基（KODMEM，Invitrogen，编号 10829-018）中培养，补充有 1 mM L-谷氨酰胺和 20% Knockout 血清替代培养基（KOSR，Invitrogen）、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸（NEAA，Invitrogen）、50 U/mL 青霉素、50 µg/mL 链霉素（Invitrogen）、0.1 mM β-巯基乙醇（Invitrogen）和 8 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Sigma no .F0291-25UG）。hESC 和 hiPSC 生长在基质胶（生长因子减少，BD Bioscience）包被的 6 孔板（康宁公司，编号 3506）上，位于来自 E13.5 CD-1 小鼠的原代 MEF 的饲养层上。大约每 7 天用胶原酶 IV（Invitrogen，编号 17104-019）进行酶消化后传代 H9 和 hiPSC 系。常规检测细胞的支原体（MycoAlert；Cambrex，
H9 衍生成纤维细胞的生成 - 通过 EB 形成对未分化的 H9 细胞进行常规的自发区分方案。简而言之，通过机械移液器研磨将胶原酶IV处理的hESC集落分配成500至800个细胞的细胞聚集体。
人类 iPS 细胞的生成 - 我们应用了标准 Yamanaka 方案并进行了少量修改。编码 hOct4、hSox2、hKlf4 和 hc-Myc 的原始 pMXs 逆转录病毒载体从 Addgene 收集，并用 VSV-G 包膜蛋白（来自索尔克研究所 Gerald Pao 的礼物）进行假型化。半汇合的 hdF 与含有所有四种病毒的上清液一起转化过夜。
免疫组织化学 - 用 PBS 冲洗细胞，在 CKX 41 倒置显微镜的明场 (BF) 中显微拍照，并用 PBS 中稀释的 4% 多聚甲醛 (PFA) 在室温 (RT) 下沉降 10 分钟。
具体的 M & M 和结果：四种不同冷冻保护剂的毒性。我们之前假设 DMSO 对 hPSC 具有本质毒性，必须用无毒的 CPA 替代。在一项初步研究中，我们发现乙二醇（1,2-乙二醇，EG）对 293 细胞的冷冻保存具有同等的保护作用，因此我们认为这种二醇是替代 DMSO 的最佳候选者。我们还测试了丙二醇（1,2-丙二醇，PG）和甘油（GLY）。将细胞在 37℃下暴露于 10% (w/w) CPA 中 30 分钟。CalceinPM+/7AAD 细胞的回收率与对照相比相当（QUANTA 可以精确测量细胞浓度，并将其转换为总细胞产量）。之后，按照常规程序将细胞分离并铺板，并在第 2 天，在第一次更换培养基之前，还收获未贴壁的细胞。未经处理的对照的平均附着效率在 65-77% 范围内，并且在孵育 2 天后，几乎 95% 的附着 iPS 细胞呈 Nanog 阳性。解离 iPS 细胞的冷冻保存 - 如上所述，细胞从含有 ECM 分子的表面脱离可导致大量细胞死亡和分化。然而，从冷冻生物学的角度来看，单细胞悬浮液的 CP 优于细胞簇。我们通过添加 Rho 激酶 (ROCK) 抑制剂 Y-27632（文中为 RI）来解决这个问题，该抑制剂有助于细胞抵抗脱离和解离。板中冷冻保存附着的细胞 - 由于标准冷冻方案需要分离，我们假设如果细胞不受其“自然”环境的干扰，则可以改善恢复。因此，我们将细胞冷冻在 4 孔板中。孵育 2 天后，几乎 95% 的附着 iPS 细胞呈 Nanog 阳性。解离 iPS 细胞的冷冻保存 - 如上所述，细胞从含有 ECM 分子的表面脱离可导致大量细胞死亡和分化。然而，从冷冻生物学的角度来看，单细胞悬浮液的 CP 优于细胞簇。我们通过添加 Rho 激酶 (ROCK) 抑制剂 Y-27632（文中为 RI）来解决这个问题，该抑制剂有助于细胞抵抗脱离和解离。板中冷冻保存附着的细胞 - 由于标准冷冻方案需要分离，我们假设如果细胞不受其“自然”环境的干扰，则可以改善恢复。因此，我们将细胞冷冻在 4 孔板中。孵育 2 天后，几乎 95% 的附着 iPS 细胞呈 Nanog 阳性。解离 iPS 细胞的冷冻保存 - 如上所述，细胞从含有 ECM 分子的表面脱离可导致大量细胞死亡和分化。然而，从冷冻生物学的角度来看，单细胞悬浮液的 CP 优于细胞簇。我们通过添加 Rho 激酶 (ROCK) 抑制剂 Y-27632（文中为 RI）来解决这个问题，该抑制剂有助于细胞抵抗脱离和解离。板中冷冻保存附着的细胞 - 由于标准冷冻方案需要分离，我们假设如果细胞不受其“自然”环境的干扰，则可以改善恢复。因此，我们将细胞冷冻在 4 孔板中。解离 iPS 细胞的冷冻保存 - 如上所述，细胞从含有 ECM 分子的表面脱离可导致大量细胞死亡和分化。然而，从冷冻生物学的角度来看，单细胞悬浮液的 CP 优于细胞簇。我们通过添加 Rho 激酶 (ROCK) 抑制剂 Y-27632（文中为 RI）来解决这个问题，该抑制剂有助于细胞抵抗脱离和解离。板中冷冻保存附着的细胞 - 由于标准冷冻方案需要分离，我们假设如果细胞不受其“自然”环境的干扰，则可以改善恢复。因此，我们将细胞冷冻在 4 孔板中。解离 iPS 细胞的冷冻保存 - 如上所述，细胞从含有 ECM 分子的表面脱离可导致大量细胞死亡和分化。然而，从冷冻生物学的角度来看，单细胞悬浮液的 CP 优于细胞簇。我们通过添加 Rho 激酶 (ROCK) 抑制剂 Y-27632（文中为 RI）来解决这个问题，该抑制剂有助于细胞抵抗脱离和解离。板中冷冻保存附着的细胞 - 由于标准冷冻方案需要分离，我们假设如果细胞不受其“自然”环境的干扰，则可以改善恢复。因此，我们将细胞冷冻在 4 孔板中。从冷冻生物学的角度来看，单细胞悬浮液的 CP 优于细胞簇。我们通过添加 Rho 激酶 (ROCK) 抑制剂 Y-27632（文中为 RI）来解决这个问题，该抑制剂有助于细胞抵抗脱离和解离。板中冷冻保存附着的细胞 - 由于标准冷冻方案需要分离，我们假设如果细胞不受其“自然”环境的干扰，则可以改善恢复。因此，我们将细胞冷冻在 4 孔板中。从冷冻生物学的角度来看，单细胞悬浮液的 CP 优于细胞簇。我们通过添加 Rho 激酶 (ROCK) 抑制剂 Y-27632（文中为 RI）来解决这个问题，该抑制剂有助于细胞抵抗脱离和解离。板中冷冻保存附着的细胞 - 由于标准冷冻方案需要分离，我们假设如果细胞不受其“自然”环境的干扰，则可以改善恢复。因此，我们将细胞冷冻在 4 孔板中。我们假设，如果细胞不受到“自然”环境的干扰，恢复情况可能会得到改善。因此，我们将细胞冷冻在 4 孔板中。我们假设，如果细胞不受到“自然”环境的干扰，恢复情况可能会得到改善。因此，我们将细胞冷冻在 4 孔板中。
讨论：虽然这些开发的许多方面都已在以前记录的协议中使用；然而，报告的结果在实验室和细胞系之间存在很大差异。我们的明显区别和创新在于将累积的数据作为一个整体来使用。另一个问题是，上述出版物中使用的回收率评估方法多种多样，使得不同结果的直接定量比较非常困难，甚至有时是不可能的。我们决定不使用任何菌落测定，因为可以接种到特定孔中的菌落的大小和数量存在很大差异，因此，使“菌落数量”成为不可靠的定量参数。相反，我们 使用排除阴性活力标记7AAD的GFP阳性细胞的数量（占收获细胞总量的%）作为贴壁细胞的特征。我们也准确地（使用 QUANTA Coulter 计数器选项）计算了未贴壁和贴壁细胞的数量，因为即使细胞在冷冻和铺板之前解离，也不可能在每个孔中铺上相同数量的细胞，特别是如果它们被冻结成块。对重新附着到孔表面的细胞与漂浮的未附着细胞的评估以及 Oct4 阳性活细胞 (7AAD-) 再附着细胞的百分比的结合将为我们提供对整体恢复的公平评估，如下所示， CP (VY) 后存活的多能 SC 的产量。我们也准确地（使用 QUANTA Coulter 计数器选项）计算了未贴壁和贴壁细胞的数量，因为即使细胞在冷冻和铺板之前解离，也不可能在每个孔中铺板相同数量的细胞，特别是如果它们被冻结成块。对重新附着到孔表面的细胞与漂浮的未附着细胞的评估以及 Oct4 阳性活细胞 (7AAD-) 再附着细胞的百分比的结合将为我们提供对整体恢复的公平评估，如下所示， CP (VY) 后存活的多能 SC 的产量。我们也准确地（使用 QUANTA Coulter 计数器选项）计算了未贴壁和贴壁细胞的数量，因为即使细胞在冷冻和铺板之前解离，也不可能在每个孔中铺板相同数量的细胞，特别是如果它们被冻结成块。对重新附着到孔表面的细胞与漂浮的未附着细胞的评估以及 Oct4 阳性活细胞 (7AAD-) 再附着细胞的百分比的结合将为我们提供对整体恢复的公平评估，如下所示， CP (VY) 后存活的多能 SC 的产量。尤其是如果它们被冻结成块的话。对重新附着到孔表面的细胞与漂浮的未附着细胞的评估以及 Oct4 阳性活细胞 (7AAD-) 再附着细胞的百分比的结合将为我们提供对整体恢复的公平评估，如下所示， CP (VY) 后存活的多能 SC 的产量。尤其是如果它们被冻结成块的话。对重新附着到孔表面的细胞与漂浮的未附着细胞的评估以及 Oct4 阳性活细胞 (7AAD-) 再附着细胞的百分比的结合将为我们提供对整体恢复的公平评估，如下所示， CP (VY) 后存活的多能 SC 的产量。
结论：在 ROCK 抑制剂和乙二醇的出现下，iPSC 与 Accutase 的解离以及贴壁阶段的可编程冷冻 (ComfortFreeze) 均显着提高了多能冷冻保存干细胞的产量（高达 6 倍），与相对标准的团块冷冻相比不含 ROCK 抑制剂。与 Accutas 解离相比，在平板中冷冻保存贴壁细胞也显示出更高的功效和更短的时间将集落恢复到未冷冻水平。
注：这项工作部分在2018年10月11-12日在俄罗斯莫斯科举行的第21届欧洲生物技术大会上展示