生殖系统与性功能障碍：当前研究
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国际标准期刊号: 2161-038X
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埃瓦·格雷戈拉斯祖克
抽象的
癌症生长细胞中的一个典型发现是组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 的过度表达，从而促进与癌发生相关的各种蛋白质的关节和运动的调整。考虑到瘦素可以调节 HDAC 的程度，我们推测瘦素受体敌人可以改变 HDAC 的关节。
材料和方法：在卵巢上皮细胞和卵泡瘤细胞（COV434、KGN）中评估呈递给瘦素和瘦素受体敌人（SHLA 和 Lan2）的细胞中的 HDAC 关节。
结果：与毛囊瘤细胞相比，在上皮细胞中发现了更高的 HDAC 关节。瘦素仅在 OVCAR-3 细胞中扩增 I 类和 II 类 HDAC，而 SHLA 的作用比 Lan-2 更强。在毛囊瘤细胞中，瘦素只是扩大了 II 类 HDAC 的连接；Lan-2 在 COV434 中的强度比 SHLA 更强，并且两种拮抗剂都不影响 KGN 细胞。
结论：SHLA和Lan2以细胞类型从属的方式消除了瘦素对HDAC连接的负面影响。这是在卵巢癌细胞中测试瘦素受体阻滞剂作为 HDAC 抑制剂的主要报告。
关键词:卵巢癌, 瘦素, 瘦素受体阻滞剂, HDACs 表达
介绍：表观遗传变化，例如翻译后组蛋白改变可以在癌症进展中发挥重要作用。两种化学物质负责组蛋白的乙酰化：组蛋白乙酰化酶 (HAT) 和组蛋白脱乙酰化酶 (HDAC)。HDAC 对 HAT 的超越促使对一些与隐匿致癌作用有关的特性的记录进行了限制。此外，HDAC 同样负责非组蛋白的脱乙酰化，从而指导细胞周期运动、增殖和凋亡。哺乳动物 HDAC 分为四类。HDAC 1、2、3 和 8 建立 I 类。HDAC 4-7、9 和 10 建立 II 类。III 类 HDAC 是 NAD+ 附属催化剂，也称为 Sirtuins (SIRT)。HDAC11，IV 类 HDAC 的主要个体，
癌症生长细胞中的一个典型发现是 HDAC 的过度表达及其扩大的运动，促使与癌发生相关的各种蛋白质的表达和作用发生改变。尽管有关卵巢疾病的信息不断发展，但仍然没有适当的方法来对抗和治疗这种恶性生长。越来越多的证据表明，I 类 HDAC 的流出在卵巢癌中增加，这不仅与在癌发生中发挥重要作用有关，而且还有助于保护免受用于奖励卵巢恶性生长的化疗药物的影响。金等人。证明 HDAC
与健康人的测试相比，来自 I 类的卵巢疾病测试中过度表达。林等人。发现在从卵巢癌生长患者获得的许多组织测试中，HDAC1和HDAC2主要与疾病细胞扩张有关，而HDAC3与细胞运动形式有关。阻碍HDAC3会导致病变细胞运动受阻。同样，HDAC 关节在卵巢癌生长且不受铂类化疗影响的患者中得到扩展。同样，HDAC4 和 HDAC6 与卵巢恶性生长阻塞和运动相关。拉宾斯卡等人。证明 HDAC 抑制剂的混合治疗可能会成功对抗各种卵巢癌的生长。
材料和方法
材料：Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 F-12 (DMEM/F-12) 购自 Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的 Gibco。杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)、RPMI-1640、胎牛样血清（FBS，热灭活）、青霉素和链霉素购自 Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。瘦素购自 Sigma Chemical Co.。瘦素受体敌人（SHLA、Lan1 和 Lan2）购自 Protein Laboratories Rehovot (PLR) Ltd.（以色列雷霍沃特）。
细胞培养：OVCAR-3（从动态卵巢腺癌患者与环磷酰胺混合化疗后的有害腹水中建立）和 CaOV-3（一种重要的卵巢恶性生长细胞系），购自美国典型培养物保藏中心（马纳萨斯） ，弗吉尼亚州，美国）。COV434 细胞获自 Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。最近描述了该细胞系的有机属性 (20)。KGN 细胞来自日本九州大学的 Masatoshi Nomura 和 Hajime Nawata (21)。CaOV-3 细胞常规在含有 10% FBS 的 DMEM 中精制，OVCAR-3 在 RPMI-1640 中用 20% FBS 增强。COV434 细胞在 DMEM + 2 mM 谷氨酰胺 + 10% FBS 中常规精制。KGN 细胞在 DMEM/F-12 + 10% FBS 中常规精制。细胞在 75 cm2 组织培养皿（Nunc，
qPCR 分析：基础 HDAC 质量阐明以及受瘦素和瘦素竞争对手影响的 HDAC 质量声明由 qPCR 决定。将细胞以1.5×104细胞/孔（CaOV-3）、1.5×103细胞/孔（OVCAR-3）、8×103细胞/孔（COV434）和1.5×104细胞/孔的厚度接种到96孔培养板中。细胞/孔（KGN）仔细考虑细胞的大小和群体繁殖时间。第二天，更换培养基并用部分40ng/ml的瘦素单独处理细胞或用SHLA和瘦素处理细胞。
Western blot分析：将细胞以2×105（CaOV-3）、3.5×104（OVCAR-3细胞）、4×104（COV434细胞）和6×104（KGN细胞）的厚度接种到24孔板中并暂时允许连接。第二天，更换培养基，并用 40 μg/ml 瘦素单独处理或与 1,000 μg/mL SHLA 或 Lan2 混合处理细胞。为了观察 HDAC 蛋白的表达，将细胞孵化 48 小时。孵育后，用超冷 PBS 洗涤细胞并用 Laemmli 裂解摇篮 (Sigma Chemical Co.) 裂解。然后将裂解的细胞划伤，移至微管中并保存在 – 70°C 下直至分析。
通过 SDS-PAGE 从每个处理束中分离出等量的蛋白质 (50 μg)，并利用 Bio-Rad Mini-Protean 3 机械组件（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA）转移至 PVDF 层。污迹暂时用 HDAC5、HDAC6 和 HDAC7 明确的必需抗体（#20458S、#7558S、#33418S Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA）以 1:1,000 弱化进行孵育。孵化后出现基本免疫反应，用 0.02 M TBS 垫中的 0.1% Tween-20 多次清洗蛋鸡，并与野兔天敌辣根过氧化物酶缀合的辅助反作用剂 (#7074 Cell Signaling Technology Inc.) 一起孵育 1 小时。 ; 减弱 1:2,000)。
组蛋白脱乙酰酶活性测定：利用原位HDAC活性荧光测定试剂盒(EPI003，Sigma Chemical Co.)估计HDAC活性。使用荧光微孔板阅读器（FLx800 Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，USA）在 368 nm 的激发频率和 442 nm 的流出频率下估计荧光项目的测量。所有示例在类似的测试中一式四份运行。
统计分析：信息以平均值±SEM 的形式传达，来自四项自主调查，一式三份。使用 GraphPad Prism 5 进行可测量的检查。使用双路径波动检查 (ANOVA) 和 Tukey 实际临界对比度 (HSD) 各种范围测试来研究信息。p<0.05 的估计被认为是事实上的关键。
结果：瘦素和瘦素受体敌人对卵巢上皮癌细胞中 HDAC 质量和蛋白质连接的影响。在 OVCAR-3 细胞系中，所有探索的 HDAC 的声明总体高于 CaOV-3 细胞，其中最值得注意的是 HDAC 1、2、3 和 7。瘦素扩展了 HDAC 1、7 的声明和9个品质。与二手阻滞剂相比，SHLA 不仅扭转了瘦素对 HDAC 1 和 9 质量和蛋白质的刺激作用，还减少了 HDAC 4 质量、HDAC 5 质量和蛋白质以及 HDAC6 蛋白质的声明。Lan-2 对 HDAC 质量表达没有影响，但对 HDAC9 蛋白的表达有明显的抑制影响。
讨论：在 60-90% 的卵巢肿瘤中描述了多种 HDAC 类蛋白的升高，并且描述了许多组蛋白和非组蛋白干预的调整，这些调整改变了细胞发育和耐力的均衡。
引入的信息清楚地表明上皮细胞中的 HDAC 质量高于颗粒细胞中的 HDAC 质量。此外，他们证明，在化疗耐药性 OVCAR-3 细胞系中，所有探索的 HDAC 的流出量基本上高于必需的 CaOV-3 细胞，其中最值得注意的是 HDAC 1、2、3 和 7。细胞中，成年结构中的 HDAC 关节比青少年结构中的低，其中最值得注意的是 COV434 细胞中发现的 HDAC9 关节。除了II类OVCAR-3中HDAC7和COV434中HDAC9的高表达之外，在所有情况下，I类HDAC的表达均高于II类。大多数研究表明，I 类 HDAC 在强人类肿瘤和私人进展中的表达得到了升级，去分化、大量增殖的肿瘤。越来越多的证据表明，I 类 HDAC 的流出在卵巢癌中增加，这不仅与在癌发生中发挥重要作用有关，还与
有助于防止化学治疗专家用于奖励卵巢癌的生长。这与我们的看法一致，即在 OVCAR-3 细胞中观察到最高的关节。
这项工作的部分内容在 2018 年 7 月 23 日至 25 日在意大利罗马举行的第 29 届欧洲-全球癌症治疗和放射肿瘤学峰会上进行了部分展示