糖类组学与脂质组学杂志
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GemSpot 允许在冷冻电镜图谱中对配体进行建模

阿鲁尼玛·辛格

冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 的最新发展现在通常可以实现生物分子的近原子和原子级分辨率。然而，确定蛋白质-配体复合物的结构仍然是一个挑战，因为结合配体的分辨率明显低于蛋白质的分辨率。因此，了解配体结合位置需要创造性的解决方案，例如结合实验数据使用计算化学方法。罗伯逊等人。开发了 GemSpot，这是一种自动计算对接管道，用于建模和评估冷冻电镜图中的配体结合姿势。它使用 GlideEM 工具进行对接，并考虑到 EM 图势作为约束。使用 OPLS3e 力场和量子力学计算完成模型细化，并使用 JAWS 预测水分子位置。  冷冻电子显微镜 (cryoEM) 已成为大分子及其复合物高分辨率结构测定的主要方法。PDB 1中沉积 的分辨率优于 4 Å 的冷冻电镜结构数量已从 2015 年的 48 个增加到迄今为止的近 1,500 个。这些结构包括许多大分子复合物和膜蛋白，这些结构通常被证明对于传统结构技术（特别是 X 射线晶体学）来说非常具有挑战性或难以处理。例如，GPCR 和离子通道是非常重要的药物靶标类别，分别占 FDA 批准药物的 33% 和 18% ，尽管最近取得了进展，但结构研究历来因其结晶相关的困难而受到限制 另一方面，CryoEM 为这些类型的大分子的结构测定提供了日益强大的工作流程4。因此，冷冻电镜为基于结构的药物发现提供了前所未有的机会，这些机会是针对最近难以处理的各种靶标。基于结构的药物发现是一种合理的药物设计方法，考虑了生物分子靶点的三维结构5。未配体的结构可用于大规模虚拟筛选，以获得具有所需生化活性的初始命中化合物。有了先导化合物，配体复合物的实验结构对于验证确切的结合模式是必要的，并且通常有助于识别修饰以提高效力。正确的姿势对于自由能扰动计算等方法尤其重要，其中化合物在分子模拟过程中通过炼金术突变为类似物，并计算结合的相对自由能，正如最近在冷冻电镜衍生的冷冻电镜上成功显示的那样人 ATP-柠檬酸裂解酶的结构此外，足够高分辨率（通常<2.5 Å）的结构将允许识别结合水分子，这在药物设计中发挥着至关重要的作用。 例如，成功的HIV蛋白酶抑制剂的开发通常涉及关键结构水的替换，鉴于冷冻电镜最近取得的显着进展，该方法将成为药物发现工作的宝贵工具，特别是对于具有挑战性的大分子复合物。由于样品制备、自动化数据收集以及能够实现高分辨率的显微镜的可用性不断提高，冷冻电镜将不可避免地用于先导化合物优化阶段，以获得与其靶标结合的中间化合物的结构。数十年的晶体学研究已经产生了强大的蛋白质-配体晶体结构建模和验证方法。虽然 X 射线晶体学和单粒子冷冻电镜原则上都是基于辐射与生物样本相互作用的散射技术，但存在一些关键差异，这些差异使冷冻电镜图中的建模变得复杂，并阻碍了为晶体结构开发的指标的使用。在晶体学中，测量的散射辐射的相位信息会丢失，需要通过附加实验信息（例如 多波长反常色散 (MAD)、同晶位移）或与已知结构的比较（分子替换）来恢复然后，通过将当前模型的计算散射与实验散射进行比较，在模型构建过程中改进初始相位值。因此，X 射线晶体学结构测定涉及模型和实验数据之间的连续串扰，同时反馈模型的质量。相比之下，在冷冻电镜中，相位很容易获得，因为它们嵌入到样本图像中，直接用于计算 3D 图。一旦从数千个实验投影中确定了最终的三维地图，该模型就会被构建到地图中，而无需来自原始电磁数据的进一步反馈。此外，在晶体学中获得的图对应于电子密度，而在冷冻电镜中，它们代表了所研究分子的库仑势。因此，使用为晶体学开发的工具直接进行冷冻电镜结构建模可能存在固有的问题。虽然迄今为止确定的大分子复合物的冷冻电镜图谱数量相对较少，但现有结构表明，蛋白质-配体复合物建模存在一些基本挑战。即使生物分子具有非常高分辨率的数据，结合配体的图谱分辨率通常也明显低于其周围环境14。鉴于冷冻电镜结构源自水溶液中的快速冷冻大分子，观察到蛋白质活性位点内某些配体的额外迁移率也许并不奇怪。此外，冷冻电镜重建很容易受到虚假图谱特征的影响，目前，不同软件从同一数据集生成明显不同的图谱是很明显的。这一特性可能是由于高分辨率下图像散焦估计和对比度传递函数校正的不准确，以及用于处理冷冻电镜数据的不同软件平台中采用的掩蔽和加权方案的变化而引起的。值得注意的是，在某些情况下，即使使用相同软件的不同设置也会产生图谱偏差，这可能对配体建模产生重大影响。 例如，二级结构约束有助于更稳健的建模。这些警告给建模者带来了在相对高分辨率的冷冻电镜图中识别配体结合姿势的挑战，导致经常不正确的配体姿势和解释，对分子机制和药物发现工作具有重大影响。与冷冻电镜的发展并行，用于模拟蛋白质-配体复合物的计算化学方法随着时间的推移也得到了显着改进。几十年来，计算力场已成功用于描述蛋白质各种构象的能量和力15。这些力场已被扩展以准确描述多种配体的能量和力，并且用户可以轻松扩展以覆盖感兴趣的配体，甚至自动扩展以覆盖初始参数化中使用的配体之外的配体。这种力场参数已用于多种应用，包括动力学以及用于计算在生物学相关条件下可访问的蛋白质和配体的构象。分子对接是一种使用力场并结合高度优化的采样和细化算法的方法，仅根据蛋白质的构象和配体的身份来预测蛋白质-配体的结合模式。 这种方法已广泛应用于识别以高亲和力与特定蛋白质结合的配体并预测其蛋白质-配体结合构象。然而，应该指出的是，在缺乏实验数据的情况下，这些纯粹的计算方法常常受到显着的阻碍。假阳性率和假阴性率。对于基于结构的药物设计，还非常重视预测水分子的位置，水分子通常协调口袋中的配体结合，并对药理活性产生深远的影响。预测水合点的多种方法，包括基于网格的方法（如 JAWS）和动态方法（如 WATERMAP） 现在能够预测结合水分子的位置。这些计算预测与实验得出的结构取得了令人印象深刻的一致性，并进一步强调了水合在先导化合物优化中的作用。因此，显然可以将一系列完善的计算工具与冷冻电镜结合使用，以解决将配体建模为冷冻电镜图的挑战。为此，我们开发并验证了“GemSpot”，这是一种计算化学方法的管道，通过结合配体对接与精化、量子力学 (QM) 计算、自动水放置和其他技术，帮助获得最可能的结合位姿。外部信息，同时考虑实验冷冻电镜数据。第一步，使用 GemSpot 将配体与流行的软件 GLIDE 对接，采用传统 GLIDE 对接评分函数和真实空间互相关评分到图谱的新颖组合。该软件称为 GlideEM，可以生成配体的几个候选姿势，然后将其 第一步，使用 GemSpot 将配体与流行的软件 GLIDE 对接，采用传统 GLIDE 对接评分函数和真实空间互相关评分到图谱的新颖组合。该软件称为 GlideEM，可以生成配体的几个候选姿势，然后将其 使用 PHENIX 进行真实空间细化 包括最先进的 OPLS3e / VSGB2.1 力场 真实空间相关系数和预细化对接分数的组合用于消除任何化学意义不大或不适合实验图的姿势。一旦识别出顶部姿势，必要时可以使用进一步的计算技术来增强主要候选姿势的置信度。对于高分辨率 EM 图，使用 JAWS 水合活性位点的自由能方法可用于帮助区分潜在的水分子与图中的噪声，并深入了解配体相互作用。当对分子的构象仍然存在疑问时，可以利用量子化学来检查与任何结合姿势相关的构象应变，例如 GAUSSIAN 或 Jaguar。在这些计算方法单独可能无法确定明确适合所有数据的单个姿势的情况下，可能有必要确定哪些顶部姿势也与其他实验的数据一致。特别有价值的是与结构-活性关系（SAR）数据的比较，即预期姿势是否可以有效解释该分子类似物的结合亲和力的变化。通过结合所得数据，即使配体分辨率较低或密度有问题，通常也可以获得高度的置信度。特别有价值的是与结构-活性关系（SAR）数据的比较，即预期姿势是否可以有效解释该分子类似物的结合亲和力的变化。通过结合所得数据，即使配体分辨率较低或密度有问题，通常也可以获得高度的置信度。特别有价值的是与结构-活性关系（SAR）数据的比较，即预期姿势是否可以有效解释该分子类似物的结合亲和力的变化。通过结合所得数据，即使配体分辨率较低或密度有问题，通常也可以获得高度的置信度。