遗传综合征与基因治疗杂志
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抽象的

使用质粒或病毒载体将基因高效离体转移至原代鼠 B 细胞

Babak Moghimi、Irene Zolotukhin、Brandon K. Sack、Roland W Herzog 和 Ou Cao

在离体基因转移和重新植入后，原代自体 B 淋巴细胞已成功用于在多种动物模型中预防自身免疫性疾病和对治疗蛋白的适应性反应。然而，将基因有效转移至原代 B 细胞需要使用逆转录病毒载体，这会增加插入突变的风险。在这里，我们评估了几种替代基因转移方法。用LPS纯化并激活静息脾B细胞，并通过核转染、脂质转染胺、腺病毒感染或鼠逆转录病毒感染的方式进行离体GFP基因转移。将腺病毒 (Ad) 载体添加到有或没有磷酸钙沉淀的 B 细胞培养物中。对于转染和核转染，使用裸露的质粒DNA。核转染技术代表了一种改良的电穿孔技术，可将核酸有效转移至细胞核，从而提高转移效率，特别是对于原代细胞。使用 GFP、CD19 和活体染料作为标记，通过流式细胞术测定离体基因转移的效率。核转染产生最高水平的基因转移，60-65% 的 B 细胞为 GFP+。逆转录病毒的效率为 30-35%，Ad5/11 的效率为 20%，Ad5/35 的效率为 15%，脂质体介导的转染效率为 5%。磷酸钙沉淀将 Ad 载体的效率提高至 30% (Ad5/11) 和 25% (Ad5/35)。Lipofectamin 引起的细胞死亡最多，为 80%，其次是核转染 (35%) 和病毒载体（每种情况下为 10-15%）。对于所有方法，C57BL/6 或 C3H/HeOuJ 小鼠 B 细胞的基因转移效率几乎相同。总之，基因转移技术的最新进展为原代 B 细胞提供了逆转录病毒载体的替代方案。如果需要稳定的基因转移，非整合载体系统可以与基于转座子或噬菌体整合酶的系统或未来的位点特异性系统相结合，以实现整合到宿主 B 细胞基因组中。