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内皮细胞翻译后蛋白S-亚硝基化的综合分析

黄斌

一氧化氮 (NO) 是一种具有不稳定特性的内源性转化蒸气原子，可以与半胱氨酸残基（Cys-NO、S-亚硝基化）结合，然后调节催化剂的运动。NO 被视为一种温和的活性氧/氮 (ROS/RNS)，可以与其他更强的 ROS/RNS 相媲美，并保护细胞免受自由极端分子带来的不可逆氧化压力的影响。目前，用于考虑 NO 在生理反应中的影响的可用系统结合了蛋白质印迹法来量化 Ser1177 和 Ser633 沉积处的内皮一氧化氮合酶 (eNOS) 的磷酸化，并通过 Griess 试剂识别气态 NO。在任何情况下，该试剂都会受到过氧亚硝酸盐 (ONOO−) 的存在的显着影响。因此，创建并使用了新的荧光测试 - 5-氨基-2-(6-羟基-3-氧代-3H-xanthen-9-yl) 苯甲酸甲酯 (FA-OMe)，它与内源性 NO 明确相关。 。

因此，NO 生成量的增加可以通过 Western 污迹中的 eNOS 磷酸化以及利用 FA-OMe 直接测量来评估。当可以确定 NO 的产生时，随后的蛋白质 S-亚硝基化的 ID 就出现了，因为 NO 对半胱氨酸积累的限制变得显着。使用市售的免疫反应和质谱设备可以直接识别 Cys-NO 的积累。然而，对于免疫反应的特殊性和Cys-NO的化合物限制微弱的解释，这两种策略都不是可靠的。因此，我们设计了一个针对半胱氨酸构建的标签组合标记框架，该框架从生物素开关转变而来（例如 IAA、IAM 和 iTRAQ）。半胱氨酸一氧化氮将被这些标签取代，然后通过基于 2-DE 的西方涂抹或具有无法区分原子量变化的质谱法进行识别。可以同时剖析化合物生成、气态 NO 原子产生和随后的蛋白质 S-亚硝基化的整个概况，以澄清有关蛋白质 S-亚硝基化活性的生理学工具的更多见解。