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整合素β8与胚胎着床的密切关系

拉杰什·库马尔·贾

抽象的

胚胎植入是一个非常复杂的过程，需要结合熟练的囊胚和开放的子宫内膜之间进行多方面的沟通。确保子宫内膜腔上皮细胞的接受性包括质膜和细胞骨架的不同基本和原子变化。整合素是细胞与细胞以及细胞与框架连接的中间人，与未发育的有机体着床过程有关，可以想象它们控制囊胚和子宫的关联。在妊娠早期，整合素 β8 似乎与胎儿-母体界面处的变化发育因子-β (TGF-β) 协同作用。无论如何，整合素β8在子宫中的确切作用及其与未发育的有机体着床的关系尚不清楚。以这种方式，

此外，我们利用延迟着床和非妊娠卵巢切除小鼠模型研究了卵巢类固醇对整合素 β8 关节的作用。我们发现整合素β8在未发育的生物体着床窗口的早期围着床阶段是上行的，并且超越了围着床阶段的早期生物体着床的目的地。着床前阶段子宫整合素β8的生物平衡和mRNA沉默抑制了未发育的生物体的着床和随后的妊娠，这表明它在早期生物体着床期间的紧迫工作。整合素 β8 可以管理其下游标记原子 STAT-3、整合素 β8、TGF-β1、Vav 和 Rac-1 在未发育的生物体着床期间在子宫内的运动。整合素β8可以通过卵巢类固醇来控制，17-β雌二醇在黄体酮中制备反应性子宫。在这项研究中，我们解释了整合素β8在胚胎植入窗口期间的关键管理工作。

介绍

整合素是参与细胞-ECM 合作的关键细胞表面受体之一。它们是异二聚体（一个 α 和一个 β 亚基）跨膜糖蛋白，由一个巨大的球状细胞外空间组成，适合 ECM 蛋白和其他细胞表面受体的特殊性，以及一个较小的细胞质区域，与许多细胞骨架蛋白连接并开始下降。正如使用阻断抗体的测试所示，这些连接在软骨细胞和软骨形成中具有重要意义。例如，阻断整合素 β1 会严重干扰软骨细胞与纤连蛋白、II 型胶原和 IV 型胶原的附着，并抑制软骨形成。整合素对于细胞周围网格的改善和去分化也很重要，

结果

shRNA慢病毒开发被用来稳定敲低ITGB8，ITGB8是一种整合素亚基，已知与休眠相关肽中不溶性TGF-β的到来有关，因此被认为在软骨分离中具有重要意义。我们的第一次试验表明，它是在软骨形成分离中可靠上调的少数几个整合素亚基之一，几乎不考虑介质结构或软骨形成模型。它描述了选择嘌呤霉素时的击倒效果。测定后，定量PCR显示静默率为89%，并且蛋白质印迹法检测不到蛋白质。延伸后，在软骨形成的微团模型中分离细胞。

与野生型相比，在整合素 β8 敲低中，软骨形成分离过程中整合素亚基的连接通常不受影响。21 天后，α 亚基没有出现可测量的显着对比。β 亚基逐渐受到影响，四天后 ITGB3 的发音难以察觉。奇怪的是，在第 0 天（微团发育之前），整合素 β8 敲低 hMSC 中的许多整合素亚基得到了上调。对于 ITGA3、ITGA4、ITGA6、ITGA7、ITGA11、ITGAV、ITGB1 和 ITGB5（全部在 ITGB8 击倒中上调）和 ITGA5（在 ITGB8 击倒中下调），这种影响实际上是巨大的。

所有表型标记均受到整合素 β8 敲低的影响。ACAN 仍然只是在软骨形成培养基中通讯，但与野生型 hMSC 相比，在 4 天后的敲低中，ACAN 基本上被下调。COL2A1 关节在整合素 β8 敲低方面发生了显着变化，但这种变化在任何时候都未被识别。与发育和软骨形成培养基中的野生型相比，两个细胞周晶格标记 COL6A1 和 HSPG2 基本上是向上的，并且在发育培养基中具有更突出的向上引导锯。21 天后，COL1A1 在软骨形成培养基中完全下调，但在发育培养基中不受影响。与发育培养基中的野生型相比，COL10A1 在第 7 天时被下调，但在第 21 天时相应地进行了传达。在软骨形成培养基中，它不受整合素β8敲低的影响。通过在发育培养基和软骨形成培养基中以不同的焦点敲低整合素β8，RUNX2关节被废除。SOX9 在软骨形成培养基中 21 天后基本受到下调，但在发育培养基中不受影响。

方法

ITGB8 的 shRNA 沉默

含有shRNA至安静ITGB8和对照（混合）shRNA的慢病毒颗粒购自Santa Cruz（德国）。利用 Cop-GFP 慢病毒颗粒升级转导条件。hMSC 以 6,000 个细胞/cm2 接种在 12 孔板中，并发育至半汇合。它们用含有 5 μg/ml 聚凝胺的发育培养基中的 10 μl/ml 感染进行转导。24小时后，更换培养基并使细胞再恢复24小时。然后将它们更换为含有 4 μg/ml 嘌呤霉素的选择培养基。三天后，汇集细胞，测试转导生产力，并在标准开发条件下精炼直至分离测试。在微团模型中进行分离并在0、4、7和21天后进行记录评估。

整合素 β8 的西方涂抹

hMSC 在 PBS 中洗涤，并在用蛋白酶（Roche，英国）和磷酸酶（Sigma，英国）抑制剂增强的 RIPA 摇篮（Sigma，英国）中裂解。通过 4°C 离心解释裂解物，并通过 Bradford 检查（Sigma，英国）评估完整蛋白质。将 Laemmli 样品缓冲液中的 15 μg 完整蛋白堆叠在 10% SDS-PAGE 凝胶上。在湿交换条件下将蛋白质转移到 PVDF 膜上。该膜在 TBS/T 中用 5% (w/v) BSA 阻碍，并在抗整合素 β8（1/200；sc-6638，圣克鲁斯，德国）和 GAPDH（1/5000；克隆 2D4A7，Thermo Fisher）的抗体中孵化。 ，英国）短期在 4°C。洗涤后，将胶片置于可选的抗 IgG 抗体（对山羊 1/5000 具有敌意，对小鼠 1/5000 具有敌意；Li-Cor Biosciences，英国）中进行孵育，命名为 IRDye。

讨论

ITGB8 是本研究中所有软骨形成模型中可靠上调的主要整合素亚基之一。鉴于其在 TGF-β 从其不活动复合物中机械和蛋白水解到达中的已知作用，我们试图展示其在软骨形成中的作用。89% mRNA 敲低促使 COL2A1（透明韧带的特征标记）出现不可辨别的关节，显示了该整合素在 hMSC 软骨形成分离中的重要性。它还带来了细胞周晶格标记 COL6A1 和 HSPG2 的上行指导，在这两种情况下，这种扩张在发育培养基中比在软骨形成培养基中更加明显。这种整合素 β8 敲低如何影响 TGF-β 标记尚不清楚，但它可能与 TGF-β 的来源有关。有证据表明，虽然 TGF-β3 具有建设性结果，但 TGF-β1 标记可能会抑制软骨形成分离。整合素 αvβ8 敲低会降低细胞启动不溶性（细胞发射）TGF-β 的能力，但不会从根本上干扰其溶剂型（中增强型 TGF-β3）发育因子。无论如何，这不能完全阐明为什么整合素 β8 的敲低对细胞表型的影响受到培养基片段的影响。未来的工作可以包括描述 TGF-β 同种型对软骨形成分离中整合素 αvβ8 干预运动的影响。整合素 αvβ8 敲除会降低细胞启动不溶性（细胞发射）TGF-β 的能力，但不会从根本上干扰其溶剂型（中增强型 TGF-β3）发育因子。无论如何，这不能完全阐明为什么整合素 β8 的敲低对细胞表型的影响受到培养基片段的影响。未来的工作可以包括描述 TGF-β 同种型对软骨形成分离中整合素 αvβ8 干预运动的影响。整合素 αvβ8 敲低会降低细胞启动不溶性（细胞发射）TGF-β 的能力，但不会从根本上干扰其溶剂型（中增强型 TGF-β3）发育因子。无论如何，这不能完全阐明为什么整合素 β8 的敲低对细胞表型的影响受到培养基片段的影响。未来的工作可以包括描述 TGF-β 同种型对软骨形成分离中整合素 αvβ8 干预运动的影响。

各种研究表明，在平台中整合整合素配体可以影响细胞行为。例如，IKVAV（一种层粘连蛋白决定的整合素配体）似乎有助于 hMSC 的合理性。在我们的检查中，我们发现ITGA3和ITGA6已知与ITGB1（由于ITGA6而与ITGB4一起）异二聚化以结合层粘连蛋白，在软骨形成分离中通常是向下定向的。这与 IKVAV 可以增强 hMSC 的发现相一致，但表明软骨细胞不会。作为后续模型，当 GFOGER（一种通过 β1 整联蛋白限制细胞的胶原模拟肽）加入聚乙二醇（PEG）水凝胶时，hMSC 经历了比单独水凝胶更显着的软骨形成分离。这同样与我们的结果一致，该研究发现了限制胶原蛋白的整合素的适度一致的连接，表明 hMSC 和软骨细胞都会对细胞外胶原蛋白产生良好的反应。最后，纤连蛋白及其肽附属物通常用于改善稳定的细胞结合，但一些研究表明，当 RGD 连接到框架中时，会对软骨形成产生负面影响。在这次检查中，我们发现一部分纤连蛋白限制性整合素（特别是ITGAV）在软骨形成过程中保持适度稳定的关节连接。这些受体的接近表明 hMSC 和软骨细胞都可以在纤连蛋白的视野内保持其表型。这是明智的，考虑到纤连蛋白在 ECM 中通过分离和发育软骨细胞都可用。特别值得注意的是，要考虑瞬时变化的整合素关节，以指导基础微生物变成软骨细胞。整合素配体，促使本次研究中确定的瞬时改变整合素关节，可以在组织设计框架中得到巩固，以影响细胞行为。这一想法已在脂肪生成和骨生成中得到了尝试，但到目前为止，针对软骨生成中的明确整合素的尝试基本上集中在阻止发育软骨细胞的去分化上。

结论

总之，我们已经完成了三种体外软骨形成模型中整合素表达的表征。

我们发现，在软骨形成分离中，整合素的连接基本上减少，并且大多数亚基的流出是短暂定向的。我们进一步分析了整合素β8的作用，发现它的敲除导致了细胞周框架结合的上行和COL2A1关节的终止。考虑了各种软骨形成模型中的整合素连接，并显示了整合素 β8 在软骨形成中的作用，这项检查提高了我们对软骨形成分离中整合素连接以及 ECM 在影响细胞行为中的作用的理解。它可以阐明组织设计平台的未来结构，以纳入配体，以考虑到软骨分离中 hMSC 不断变化的抓握需求。