糖类组学与脂质组学杂志
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在 Cyp7b1�??/�?? 中开采氧甾醇 小鼠大脑和血浆：与 5 型痉挛性截瘫的相关性

安娜·梅尔琼

人类缺乏细胞色素 P450 (CYP) 7B1（也称为氧化甾醇 7α-羟化酶）会导致遗传性痉挛性截瘫 5 型 (SPG5)，在某些情况下还会导致婴儿出现肝脏疾病。SPG5 的医学特征是皮质脊髓束中运动神经元的丧失。为了更好地了解这种疾病的基本生物化学，我们扩展了之前对 Cyp7b1 敲除 (-/-) 小鼠大脑和血浆中氧甾醇含量的分析，除其他甾醇外，还包括 25-羟基化胆固醇代谢物。尽管野生型 (wt) 和基因敲除小鼠的脑胆固醇水平没有差异，但我们发现，使用电荷标记方法结合液相色谱-质谱 (LC-MS) 和多级裂解 (MSn)，Cyp7b1-/- 小鼠大脑和血浆中存在 CYP7B1 底物 25-羟基胆固醇 (25-HC) 积聚。如前所述，(25R)26-羟基胆固醇 (26-HC)、3β-羟基胆甾醇-5-en-(25R)26-油酸和 24S,25-环氧胆固醇 (24S,25-EC) 水平在大脑和血浆。已知侧链氧甾醇（包括 25-HC、26-HC 和 24S,25-EC）可与 INSIG（胰岛素诱导基因）结合并抑制 SREBP-2（甾醇调节元件结合蛋白 2）对其进行加工。活性形式作为胆固醇生物合成的主要调节剂。我们建议，Cyp7b1-/- 小鼠大脑中的胆固醇浓度是通过平衡因 CYP7B1 损失而导致的新陈代谢降低和生物合成减少来维持的。Cyp7b1-/- 小鼠没有表现出运动缺陷；人类的缺陷是否是大脑中胆固醇稳态效率较低的结果尚未可知。细胞色素 P450 (CYP) 7B1（细胞色素 P450 家族 7 亚家族 B 成员 1）于 1995 年首次被鉴定，发现主要在啮齿类动物的大脑中表达。CYP7B1 是一种氧甾醇和类固醇 7α-羟化酶，接受许多氧甾醇和胆固醇酸以及包括脱氢表雄酮 (DHEA) 在内的类固醇作为底物。在人类中，这种酶的缺乏首先是在一个十周大的男孩身上发现的 CYP7B1 是一种氧甾醇和类固醇 7α-羟化酶，接受许多氧甾醇和胆固醇酸以及包括脱氢表雄酮 (DHEA) 在内的类固醇作为底物。在人类中，这种酶的缺乏首先是在一个十周大的男孩身上发现的 CYP7B1 是一种氧甾醇和类固醇 7α-羟化酶，接受许多氧甾醇和胆固醇酸以及包括脱氢表雄酮 (DHEA) 在内的类固醇作为底物。在人类中，这种酶的缺乏首先是在一个十周大的男孩身上发现的 出现严重的肝脏疾病。在最近的研究中，用鹅去氧胆酸治疗另一名患有这种酶缺乏症的婴儿已被证明可以成功解决肝脏疾病[6]。CYP7B1 在人类海马中表达，有趣的是，阿尔茨海默病受试者的齿状神经元中 CYP7B1 mRNA 显着减少。在小鼠中，尽管 Cyp7b1 的氧甾醇底物 25-羟基胆固醇 (25-HC) 和 26-羟基胆固醇（可能是 25R-差向异构体，26-HC，也称为 27 -羟基胆固醇，见补充材料，表 S1 的缩写、通用和系统名称）[8]。根据这些小鼠数据，Tsaousidou 等人感到惊讶。2008 年发现 CYP7B1 的序列改变与人类遗传性痉挛性截瘫 5 型 (SPG5) 有关 [9]。随后的研究证实，患有 SPG5 的患者具有 CYP7B1 失活的代谢表型特征。为了了解小鼠和人类在 CYP7B1 缺陷方面的差异，我们利用酶辅助衍生化进行甾醇分析 (EADSA) 和液相色谱-质谱 (LC-MS) 对小鼠大脑和血浆进行了立体组学研究具有多级碎片 (MSn)。我们之前发现，在 Cyp7b1 敲除 (Cyp7b1-/-) 小鼠大脑中，胆固醇浓度与野生型 (wt, Cyp7b1+/+) 相似，24S-羟基胆固醇 (24S-HC) 水平也相似。 14]。另一方面，(25R)26-羟基胆固醇(26-HC)、3β-羟基胆固醇-5-en-(25R)26-油酸(3β-HCA)和24S,25-环氧胆固醇(24S,25-EC)的浓度升高，推测是 CYP7B1 底物。现在，深入研究甾醇组，我们发现 Cyp7b1-/- 小鼠大脑中 25-HC 和 26-羟基去甾醇 (26-HD) 也升高，而 7α,25-二羟基甾醇丰度减少，但其他氧甾醇 24R-羟基胆固醇 (24R-HC)、7α- 和 7β-羟基胆固醇 (7α-HC、7β-HC) 两种基因型之间的浓度没有变化。我们认为，大脑中 25-HC、26-HC 和 24S,25-EC 水平升高，通过抑制 SREBP-2（甾醇调节元件结合蛋白 2）加工成其活性形式，从而减少胆固醇生物合成基因的表达，如下所示：甲羟戊酸途径的主转录，从而减少胆固醇合成并补偿其代谢减少（通过 CYP7B1 途径），从而将 Cyp7b1-/- 小鼠大脑中的胆固醇水平维持在野生型水平。25-HC、24S、25-HC、3β-HCA 以及一些研究中的 26-HC 均被发现是肝脏 X 受体（LXRα、NR1H3；LXRβ、NR1H2）的配体，其激活会增加肝脏 X 受体的表达ATP 结合盒转运蛋白 A1 (ABCA1) 和载脂蛋白 E (APOE) 的转运蛋白和载体蛋白对于维持神经元中正确的甾醇水平非常重要 [19] 并避免潜在有毒的氧甾醇造成的过载。大脑和血浆样本来自 13 个月和 23 个月大的雄性小鼠。Cyp7b1-/- 和 Cyp7b1+/+ 小鼠是爱丁堡大学动物设施中 Cyp7b1+/- 杂交产生的同窝小鼠。所有小鼠均饲养在标准条件下（7：上午 00 点至下午 7:00 光照/黑暗周期，21°C），随意提供食物和水。组织取样是在 1986 年英国科学程序（动物）法案的支持下进行的，该法案于 2012 年进行了修订，以符合欧洲指令 2010/63/EU。该研究是根据 PPL No.70/7870 进行的，并事先获得了爱丁堡大学动物福利和伦理审查机构的批准。所有小鼠均于早晨通过颈椎脱臼处死，收集躯干血并取出大脑，冷冻在干冰粉上并储存在-80°C。包括氧甾醇在内的甾醇按照中所述从脑中提取。简言之，将小鼠脑在含有同位素标记的内标的乙醇中匀浆，并通过反相 C18 柱上的固相萃取 (SPE) 分离富含氧甾醇和胆固醇的级分。然后将富含氧甾醇的级分分成两等份（a和b），第一份用来自链霉菌属的胆固醇氧化酶处理。将 3β-羟基-5-烯基团氧化为 3-氧代-4-烯等价物，适合随后用 Girard P (GP) 试剂进行衍生化（即组分 a）。在不存在胆固醇氧化酶的情况下，直接用GP试剂处理氧甾醇级分的第二等分试样（即级分b）。这使得具有天然 3-oxo-4-ene 结构（组分 b）的氧甾醇与具有 3β-羟基-5-烯结构的氧甾醇（即（组分 a）-（组分 b））区分开来。富含胆固醇的级分被单独处理，但处理方式与富含氧固醇的级分相同。血浆样品的制备如 Autio 等人所述。和克里克等人。通过提取到乙醇中，然后进行 SPE 来分离富含胆固醇和氧甾醇的组分。然后用GP试剂将氧甾醇衍生化，并预先用胆固醇氧化酶进行氧化（级分a）或不进行（级分b）。对于血浆分析，两种 GP 试剂分别使用 [2H0]GP 和 [2H5]GP 与组分 a 或组分 b。这使得可以对用胆固醇氧化酶处理（组分 a）或不用（组分 b）制备的氧甾醇组分进行双重 LC-MS 分析 使用 Ultimate 3000 LC 系统通过 LC-MS (MSn) 分析氧化/衍生的富含氧甾醇的组分（Thermo Fisher Scientific，拉夫堡，英国）和 LTQ-Orbitrap 质谱仪（Thermo Fisher Scientific，拉夫堡，英国）如 Meljon 等人所述。和克里克等人。。简单来说，GP 衍生的氧甾醇在反相 Hypersil Gold C18 柱（Thermo Fisher Scientific）上使用甲醇/乙腈/0.1% 甲酸梯度进行分离。将洗脱液导入电喷雾电离源 (ESI) 并通过高分辨率（60,000 at m/z 400）MS 和 MS3 ([M]+→[M-Py]+→，其中“-Py”对应于分子离子 M+ 中吡啶基团的丢失）分别在 Orbitrap 和 LTQ 线性离子阱中并行进行扫描。使用同位素稀释法进行定量。其中“-Py”对应于分别在 Orbitrap 和 LTQ 线性离子阱中并行执行的分子​​离子 M+）扫描中吡啶基团的丢失。使用同位素稀释法进行定量。其中“-Py”对应于分别在 Orbitrap 和 LTQ 线性离子阱中并行执行的分子​​离子 M+）扫描中吡啶基团的丢失。使用同位素稀释法进行定量。