免疫治疗：开放获取
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多重免疫组织化学：生成经过验证的方案时染色顺序的重要性

吉哈德·赛义德 / 杰克·阿什顿 / 杰瑟克里斯托弗·约瑟夫 / 杰玛·N·琼斯 / 克里斯蒂安·史莱特 / 艾伦·夏普 / 加里·阿什顿 / 威廉·豪瓦特 / 理查德·拜尔斯 / 海伦·K·安吉尔

目的：癌症等多因素疾病的复杂性对个性化疗法的开发提出了重大挑战。肿瘤的综合数字组织学分析可以更好地了解免疫微环境以及与特定肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 亚群的计数和分布相关的预后关系。为此，多重细胞标记与多光谱成像 (MSI) 一起越来越多地用于实现更准确的原位 TIL 表型分析和定量。然而，这些方法需要在使用前进行充分验证，这是本研究的基本目的。

方法：使用富含淋巴细胞的组织的整个切片和组织微阵列来开发和验证多重免疫荧光 (IF) 方案，用于同时 MSI 询问多达 6 种感兴趣的免疫细胞抗原；CD3、CD8、FOXP3、CD20、PD-L1 和 PD1。首次实现了单重显色免疫组织化学 (IHC) 和单重免疫荧光 (IF) 染色之间的一致性。随后，研究了多重 IF 顺序中的位置对任何给定抗体的影响，了解抗体空间位阻和抗体剥离条件的影响。

结果：在使用抗原修复来剥离先前抗体的多重分析方法中，影响多重测定验证的主要复合因素是热诱导表位修复 (HIER) 延长时间的非线性和非均匀效应，因为抗体在多路复用协议中按顺序前进。

结论：本研究证明了多重染色作为单重染色的代表的保真度、抗体染色顺序的影响，并为生成优化的多重免疫荧光方案提供了框架。