糖类组学与脂质组学杂志
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使用 MALDI-Q-IT-TOF 对单克隆抗体进行 N-聚糖分析

古尔塞·厄兹曼

单克隆抗体 (MAb) 越来越多地用于治疗癌症或其他自身免疫性疾病。MAb 的正确聚糖结构对于相关 Mab 的功能和生物活性至关重要，例如识别免疫系统细胞触发的抗原、调节信号活动和所产生的治疗药物的理化特性等。因此，聚糖结构的快速监测非常关键用于治疗药物生产、生物仿制药生产及其质量控制过程。

本研究的主要内容是单克隆抗体聚糖结构的表征。在我们的研究中，对用作治疗​​乳腺癌的药物曲妥珠单抗的聚糖结构进行了表征。通过胰蛋白酶消化和 PNGase F（肽：N-糖苷酶 F）裂解，N-聚糖从曲妥珠单抗蛋白质结构中酶促释放。此外，在 MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱）检测之前，使用特殊的缓冲液交换和固相萃取程序进行净化。

在设计适当的样品处理和优化后，MALDI-Q-IT-TOF MS 可以清楚地检测到 GO、GOF、G1、G1F、GOF-GN 聚糖，无需任何标记或使用任何额外的色谱分离方法。

当前演讲涉及 MALDI-Q-IT-TOF MS 用于单克隆抗体聚糖研究的理论和实验方面。将讨论 MALDI-TOF-MS 测量的样品制备程序和技巧，并介绍从 MALDI-Q-IT-TOF MS 获得的原始数据。

 糖基化是制药行业开发和生产治疗性单克隆抗体 (mAb) 的关键属性。传统的抗体聚糖分析通常通过聚糖释放后的 2-氨基苯甲酰胺 (2-AB) 亲水相互作用液相色谱 (HILIC) 方法来实现。尽管这种方法产生了令人满意的结果，但它在筛选大量样品方面的用途有限，因为它需要昂贵的试剂并且需要几个小时甚至几天的样品制备时间。没有简单快速的聚糖分析方法。为了克服这些限制，我们

 

 

开发并比较了两种超快速抗体聚糖分析 (UMAG) 方法，这些方法涉及在有机溶剂或水性缓冲液中快速生成和纯化糖肽，然后使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱进行无标记定量。两种方法都能快速产生与 2-AB HILIC-HPLC 方法获得的测试抗体 N-聚糖谱相似的测试抗体 N-聚糖谱。此外，在水性缓冲液中执行的 UMAG 方法的测定时间较短，不到 15 分钟，并且能够在 96 孔 PCR 板中进行高通量分析，并且只需最少的样品处理。这种方法是迄今为止报道的最快、最简单的方法，已针对各种细胞培养条件下表达的 mAb 的糖谱分析进行了评估，以及抗体培养克隆和各种生产批次的评估。重要的是，该方法灵敏地捕获了传统 2-AB HILIC-HPLC 或 HILIC-UPLC 检测到的糖谱变化。该方法简单、快速、低成本，可促进新型单克隆抗体和生物仿制药产品的基础研究和工艺开发。

(MALDI) 源、四极离子阱 (QIT) 和反射飞行时间 (reToF) 质谱仪 (MS) 已经开发出来。已经进行了计算机模拟来模拟不同的方法，以有效地将 MALDI 离子引入 QIT 中，并随后将离子从 QIT 中提取到双级无网格 reToF。系统参数经过优化以获得接近 100% 的捕获效率和最高的质量分辨率。建造了原型仪器来实现计算机模拟预测的性能。开发了近正交激光照射样品、快速切换大幅射频 (RF) 电压和无栅双级反射器的方法。ⁿ ) 分析。获得了m/z高达16,000的高质谱图，并 成功进行了MS ^3实验。质量分辨率超过 3,000 时，灵敏度达到 0.1 fmol。

治疗性单克隆抗体 (mAb) 是活细胞系统产生的糖蛋白。附着在蛋白质上的聚糖部分可以直接影响蛋白质的稳定性、 生物活性和免疫原性。因此，必须充分分析和控制糖蛋白产品的聚糖变体，以确保产品质量。然而，蛋白质糖基化固有的复杂性提出了严峻的分析挑战。本综述提供了聚糖分析的最新进展，包括基于凝集素的微阵列在高通量聚糖分析中的潜在用途。重点是比较用于确定独特聚糖特征（如糖基化位点、聚糖结构和含量）的主要分析类型。

 

传

她于 2006 年获得埃格大学理学院生物化学学士学位。她目前正在撰写关于“单克隆抗体的聚糖分析”的硕士论文，将于 2017 年夏季毕业。同时，自2008年起，她在药物研发和药代动力学应用中心（ARGEFAR）担任科研人员。她的专业经验包括HPLC、LC MS、MALDI TOF MS技术的使用。她的研究兴趣包括生物仿制药和生物制药的理化表征。