当前合成与系统生物学
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抽象的

基于 PCR 的大肠杆菌细胞中 Bst DNA 聚合酶的基因合成、克隆、表达、纯化和表征

Malarveli Suppan、Shaharum Shamsuddin、Asma Ismail 和 Venugopal Balakrishnan

基因合成是一种修饰基因以研究基因功能、结构和表达的技术。基因合成有多种基于 PCR 的策略和非基于 PCR 的策略。在这里，我们结合组装 PCR 和顺序重叠延伸 PCR 策略进行两步基因合成，以合成全长 Bst DNA 聚合酶 (2,648bp) 并在大肠杆菌细胞中表达该蛋白质。全长 Bst DNA 聚合酶分为 5 个短 DNA 片段，寡核苷酸设计用于整个序列，每个片段具有 40-45 个聚体。步骤1中，将各个片段的寡核苷酸进行组装，然后通过组装PCR方法分别扩增基因片段。在步骤 2 中，依次将相邻的两个片段通过重叠延伸PCR一次组装，直至全长基因完全合成，最后克隆至pCR®2.1-TOPO载体中。然后将全长Bst DNA pol基因亚克隆到pET28a(+)表达载体中，最终在BL21(DE3)大肠杆菌细胞中表达。通过 MALDITOF 分析鉴定纯化的蛋白质。将重组Bst DNA聚合酶的聚合活性与商业酶进行比较。98kDA 重组 Bst DNA 聚合酶通过解旋酶依赖性扩增 (HDA) 成功扩增 100bp DNA 片段。通过 MALDITOF 分析鉴定纯化的蛋白质。将重组Bst DNA聚合酶的聚合活性与商业酶进行比较。98kDA 重组 Bst DNA 聚合酶通过解旋酶依赖性扩增 (HDA) 成功扩增 100bp DNA 片段。通过 MALDITOF 分析鉴定纯化的蛋白质。将重组Bst DNA聚合酶的聚合活性与商业酶进行比较。98kDA 重组 Bst DNA 聚合酶通过解旋酶依赖性扩增 (HDA) 成功扩增 100bp DNA 片段。