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制药科学 2018：乐伐替尼在体外和体内对未分化甲状腺癌表现出抗肿瘤活性-Silvia Martina Ferrari-比萨大学

西尔维娅·玛蒂娜·法拉利

介绍

乐伐替尼是一种口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂，作用于血管内皮生长因子受体 1-3、成纤维细胞生长因子受体 1-4、PDGFRα、RET 和 v-kit Hardy-Zuckerman 猫肉瘤病毒癌基因同源信号网络血管生成。

体外 研究已在临床前模型中评估了乐伐替尼。Lenvatinib 通过抑制 CCDC6-RET 人甲状腺和肺癌细胞系的增殖，降低 KIF5B-RET、CCDC6-RET 和 NcoA4-RET 的自身磷酸化，并阻断 RET 基因融合转化的 NIH3T3 细胞的致瘤性。

体内 II 期和 III 期研究表明，对放射性碘无反应的侵袭性 DTC 患者，与安慰剂相比，服用乐伐替尼可改善无进展生存期。批准用于治疗局部复发或转移性、进展性、放射性碘难治性 DTC 患者。

在本研究中，我们旨在评估乐伐替尼在 ATC 连续细胞系和原代 ATC 细胞培养物中的体外 和 体内抗肿瘤活性 。

 

材料与方法

  化学品和补充剂

在原代 ATC 细胞培养物、8305C 细胞和 AF 细胞以及 CD nu/nu 小鼠的 AF 细胞中对乐伐替尼进行了评估。化学品和补充剂购自 Sigma-Aldrich。RPMI-1640培养基购自Gibco。用于定量PCR的PCR试剂购自Applied Biosystems。

甲状腺组织

通过手术从 9 名 ATC 患者和 5 名接受甲状旁腺切除术的健康受试者中采集甲状腺样本。诊断是由公认的实验室根据临床和组织学标准做出的。免疫组织化学显示甲状腺组织中不表达TSH受体、钠同向转运体、甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白。

  细胞培养 人原代ATC细胞培养物 甲状腺滤泡细胞培养 AF细胞系 细胞活力和增殖的评估 细胞凋亡：Hoechst 摄取和膜联蛋白 V 结合测定 迁移和入侵测试 ATC 细胞中的 ELISA 测试 基于磷酸化-EGFR 抑制的细胞测定 ERK1/2 和 Akt ELISA 在乐伐替尼处理的 ATC 细胞中对 Cyclin D1 蛋白表达进行定量 体内研究

动物和治疗

Envigo 提供的六周大 CD nu/nu 雄性小鼠被饲养在通风架上的微型隔离笼中，并使用无菌技术进行操作。根据意大利法律 D.lgs，涉及动物的饲养和程序是根据比萨大学负责动物福利的学术组织批准的协议进行的。26/2014，并经意大利卫生部批准。

肿瘤组织：免疫组织化学和微血管密度测定

对两个治疗组的肿瘤样本进行称重，然后固定在福尔马林中，随后包埋在石蜡中。如前所述，5 µm 厚的切片用苏木精和曙红染色。

统计分析

对每个受试者进行一式三份的实验，并报告 TFC 和 ATC 细胞的样本平均值。单向方差分析、Mann-Whitney U 检验用于比较正态分布变量的平均组值。 组间比例比较采用χ ^2检验。使用 Bonferroni-Dunn 检验对正态分布变量进行事后比较。

结果

ATC 细胞的体外研究

细胞增殖评价

从乐伐替尼治疗后 TFC 细胞的 WST-1 测定中获得的数据表明，与对照组相比，使用乐伐替尼 10 µM、25 µM 和 50 µM 治疗 1 小时以及使用乐伐替尼 10 µM 治疗 2 小时时，增殖率略有但显着降低。 、25 µM 和 50 µM。细胞计数证实了这些结果：1小时后，TFC对照中的细胞数为10,150±620/100 µl/孔；乐伐替尼 10 µM 时为 9,642±1,100 (95%)；乐伐替尼 25 µM 时为 9,238±960 (91%)；仑伐替尼 50 µM 时为 8,625±950 (85%)；2小时后，细胞数为17,500±820/100μl/孔；乐伐替尼 10 µM 时为 15,925±1,120 (91%)；乐伐替尼 25 µM 时为 14,874±1,060 (85%)；仑伐替尼 50 µM 时为 14,350±980 (82%)。

增殖和 BRAF

在存在/不存在 ^V600E BRAF 突变的情况下，来自肿瘤的 ATC 的增殖以类似的方式受到抑制。

 

细胞凋亡评估

Lenvatinib 是一种剂量依赖性增加 ATC 细胞凋亡的药物。膜联蛋白 V 测定证实了这些结果。

 

迁移和入侵测试

达到亚汇合后，用浓度递增的乐伐替尼处理原代 ATC 细胞培养物。根据 Transwell 小室的评估，仑伐替尼抑制迁移和侵袭。

  抑制EGFR

ATC 细胞裂解液中 EGFR 磷酸化形式的乐伐替尼显着且呈剂量依赖性降低。

抑制 Akt 或 ERK1/2 磷酸化

在 ATC 细胞培养物中，乐伐替尼处理的样品中磷酸化/非磷酸化的 Akt 或 ERK1/2 蛋白显着减少。

 

仑伐替尼降低细胞周期蛋白 D1 蛋白水平

与媒介物处理的细胞相比，乐伐替尼降低了细胞周期蛋白 D1 浓度。

  8305C 和 AF 细胞的体外研究

仑伐替尼在 8305C 细胞和 AF 细胞中具有剂量依赖性抗增殖活性。暴露于 lenvatinib 10 µM 后，19.8% 的细胞凋亡，而暴露于 lenvatinib 25 或 50 µM 时，分别有 25% 和 30.8% 的细胞凋亡。

 

体内研究 仑伐替尼可减少 AF 肿瘤生长，且体重不会减轻

与对照组相比，乐伐替尼从治疗开始后第 7 天开始显着减少肿瘤生长。值得注意的是，在整个实验过程中没有观察到体重减轻，表明乐伐替尼治疗具有良好的耐受性。

 

讨论：

TKI 治疗 ATC 效果的研究正在进行中。在本研究中，我们证明乐伐替尼 在体外抑制原代 ATC 细胞培养物增殖，同时还增加细胞凋亡并抑制迁移和侵袭。此外，乐伐替尼 在体外抑制8305C和AF细胞的增殖，同时还增加CD nu/nu小鼠的细胞凋亡并减少AF细胞肿瘤的生长，且无毒性。这些结果与之前的研究一致，之前的研究发现乐伐替尼能够抑制 体内ATC 细胞系的肿瘤生长 ，并通过降低血管通透性来破坏血管生成。

在本研究中，我们首次揭示了乐伐替尼（一种多靶点激酶抑制剂）在从患者获得的原代人 ATC 细胞培养物中的抗肿瘤作用。这些发现可能为乐伐替尼治疗 ATC 患者的临床应用开辟道路。

注：这项工作的部分成果已于 2018 年 2 月 26 日至 27 日在英国伦敦举行的第 12 届世界制药科学与制药行业创新大会上发表