生物化学与药理学：开放获取
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抽象的

磷酸化介导的泛素识别调节

朱利叶斯·T·东德姆

泛素是真核生物中重要的细胞信号蛋白。近年来的研究表明，泛素本身可以通过磷酸化进行修饰，从而进一步调节其调节功能，然而，这种额外修饰的完整生理（和病理）意义（例如，在线粒体清除受损期间的 PINK1-Parkin 通路中）尚不清楚。此外，无底物或“非锚定”多聚泛素链也已被确定发挥重要功能，例如在 NF-kB 途径中，但这些是否通过磷酸化进行修饰尚不清楚。目前的研究基于这样的假设：除了特征蛋白parkin、NDP52和OPTN之外，还有其他未发现的泛素结合蛋白和泛素结合域可以区分未修饰和磷酸化的泛素。此外，该项目假设非锚定（无底物）多聚泛素链受磷酸化调节。因此，本研究旨在对具有磷酸化 Ser65 泛素选择性的哺乳动物效应蛋白进行编目，并确定未锚定的多聚泛素链是否也受到磷酸化的调节。使用泛素和磷酸-Ser65-泛素琼脂糖凝胶进行亲和层析，在选定的缓冲液中纯化来自 NSC-34 细胞的蛋白质，并在猪脑皮层中进行进一步研究。从珠子上洗脱结合的蛋白质，通过 SDS-PAGE 解析并通过银染色进行分析，蛋白质印迹并通过基于无标记 LC-MS/MS 的蛋白质测序进行鉴定。通过 ZnF-UBP 结构域亲和层析纯化来自 HEK293T 细胞的内源性未锚定多聚泛素链。我们提供的证据表明，与磷酸-Ser65-泛素相比，来自 NSC-34 细胞的去泛素化酶 USP5、USP3 和 UCHL1 优先结合未修饰的泛素，而 HDAC6 则不然。野生型、磷酸模拟物（S65D 和 S65E）和对照（S65A）泛素突变体在大肠杆菌中成功生成为重组蛋白，作为市售 pSer65-泛素的替代品，并证实 USP5 和 UCHL1 的结合减少。LC-MS/MS 分析表明各种潜在的新型蛋白质通过与泛素和/或磷酸-Ser65-（聚）泛素的非共价连接进行差异调节。还，与对照相比，在 MG-132 处理的 HEK293T 细胞中检测到未锚定的多聚泛素链水平增加，并且这些细胞含有 Lys48 连接。我们发现，从 CCCP 处理的 HEK293T 细胞中纯化的未锚定多聚泛素是 Ser65 磷酸化的。