糖类组学与脂质组学杂志
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癌细胞系分泌的核糖体蛋白 S3 被 N-糖基化

金俊

核糖体蛋白S3(rpS3)是40S核糖体小亚基的组成部分，但具有多种其他核糖体外功能，如细胞凋亡、细胞周期控制、DNA修复等。它具有DNA修复核酸内切酶活性，与多种癌症有关。最近，我们发现这种蛋白仅以同二聚体的形式从各种癌细胞系中分泌，但在正常细胞中不分泌。我们还证实，侵袭性更强的癌细胞系将更多的 rpS3 分泌到培养基中。目前我们证实分泌蛋白在Asn 165残基处被糖基化，并且该位点的点突变导致分泌缺陷。分泌途径被证明是内质网-高尔基体依赖性途径。我们建议糖基化 rpS3 可用作有用的癌症标记物。 当核糖体蛋白 S3 (rpS3/RPS3/核糖体蛋白 S3) 是 40 S 核糖体小亚基的组成部分（在翻译中发挥作用）时，rpS3 显示出轻微的向下移动。核糖体外功能包括 DNA 修复、细胞凋亡和转录调节。RpS3 与 nm23-H1 相互作用，后者在某些人类肿瘤中充当转移抑制剂，并防止 HT1080 细胞的侵袭潜力。此外，rpS3在结直肠癌细胞中过度表达，表明rpS3的水平可能与肿瘤发生有关。先前的一项研究表明，rpS3 以二聚体形式分泌到细胞外环境中。与正常亲本细胞相比，高度恶性细胞的rpS3分泌水平显着增加。这表明分泌的 rpS3 可能是恶性肿瘤的假定标志物。大约 10% 的人类蛋白质是分泌蛋白。这些包括细胞因子、激素、消化酶和免疫球蛋白。它们的各种功能包括免疫防御、细胞间通讯、形态发生、血管生成、细胞凋亡和细胞分化。大多数具有氨基末端或内部信号序列的分泌蛋白靶向细胞表面或细胞外空间。信号序列通过信号识别蛋白 (SRP) 进行识别，并在蛋白质进入内质网 (ER) 后被切割。新合成的蛋白质离开内质网，并被含有货物的外壳蛋白复合物 II (COPII/SEC23A) 包裹，将它们运送到高尔基体，在那里它们被修改、加工、分类并发送到最终目的地。经过高尔基体后，分泌蛋白被分类并包装成高尔基体后转运中间体，该中间体移动到质膜并与细胞表面融合。翻译后修饰在真核分泌蛋白中很常见。蛋白质糖基化是所有生物体中最丰富的翻译后修饰之一，是指糖部分与蛋白质的连接。糖基化参与蛋白质折叠、相互作用、稳定性、移动性、细胞粘附和信号转导。分泌蛋白的聚糖对于蛋白分泌很重要，因为它们影响蛋白折叠，为凝集素伴侣提供配体，有助于内质网的质量控制监测，并介导整个分泌途径的转运和选择性蛋白靶向。糖基化的两种主要类型是N-连接糖基化和O-连接糖基化。聚糖通过与天冬酰胺 (Asn) 侧链的酰胺键连接到多肽结构上，而糖苷键则与丝氨酸/苏氨酸 (Ser/Thr)、羟赖氨酸或酪氨酸 (Tyr) 的侧链发生连接，后者涉及 O-糖基化。大约一半的人类蛋白质是糖蛋白，其中大多数含有 N-聚糖结构。N-聚糖最初被合成为脂质连接的寡糖前体，并从脂质连接的寡糖转移至已进入内质网内腔的多肽的选定的Asn残基。真核生物通常在内质网膜的腔面上使用多亚基寡糖转移酶来催化聚糖转移到受体肽序列，它们由 Asn-X-(Ser/Thr) 三肽（以及较少见的 AsnX-半胱氨酸 (Cys) 和其他非标准序列肽）组成，其中 X 可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。寡糖基转移酶促进 Asn 侧链酰胺与寡糖之间的 N-糖苷键连接。几乎所有糖蛋白的聚糖在穿过高尔基体时都会受到修剪和延伸。本研究表明 rpS3 通过 ER-高尔基体依赖性途径分泌到细胞培养基中。使用 ELISA 检测检测到的分泌物可用作体外癌细胞恶性程度的指标。还证明 N-连接糖基化对于 rpS3 分泌很重要，并且 Asn165 是 N-糖基化位点，通过液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 和定点诱变证实。最后，rpS3 通过中间和 N 末端区域的相互作用形成同二聚体。结果 rpS3 的分泌受到布雷菲德菌素 a、衣霉素和莫能菌素的抑制，rpS3 似乎位于细胞质和细胞核中。此前有报道称，rpS3 作为同二聚体分泌到细胞外环境中。尽管分泌机制尚不清楚，但rpS3的分泌似乎与癌细胞的侵袭性恶性肿瘤有关。为了确认rpS3的分泌是否受到ER到高尔基体或高尔基体到ER的途径的调节，用Brefeldin A作为ER-Golgi转运抑制剂或莫能菌素作为Golgi-ER转运抑制剂处理HT1080细胞。融合度70~80%时，HT1080 细胞在存在或不存在 Brefeldin A 或 Tu 的情况下在 DMEM 无血清培养基中孵育。收集并沉淀每种培养基进行免疫印迹、ELISA和免疫组织化学测定布雷菲德菌素A和莫能菌素减少rpS3的分泌。为了进一步确认 rpS3 蛋白在 ER 或高尔基体中的定位，使用 rpS3 抗体和用于 ER 的 ER-Tracker™ Red 染料或用于高尔基体的 BODIPY TR 染料进行共聚焦免疫荧光分析。与未处理的细胞相比，布雷菲德菌素 A 和莫能菌素处理的细胞中 rpS3 在 ER 和高尔基体中的定位明显增加。使用绿色荧光蛋白 (GFP) 标记的 rpS3/GFP 进行荧光激活细胞分选 (FACS) 分析，通过 Brefeldin A 或莫能菌素处理，rpS3 在 ER 或高尔基体中的稳定细胞系定位增加了 10 倍以上。这些结果表明 rpS3 通过 ER-Golgi 和 Golgi-ER 途径从 HT1080 细胞分泌。为了量化分泌的 rpS3 的 ELISA 测定，我们用重组 rpS3 蛋白进行了 ELISA 测定。 为了确定糖基化对于 rpS3 的分泌是否是必需的，用衣霉素处理 HT1080 细胞以抑制前体 N 连接聚糖链与新生肽的附着，并进行免疫印迹测定和 ELISA 测定。在衣霉素存在下，rpS3 的分泌水平降低，表明 rpS3 的分泌需要 N-糖基化。用相关抗体探测微管蛋白和C23，以排除培养基中检测到的rpS3可能源自坏死或破裂的可能性。在细胞培养基中未检测到核标记物 C23（NCL/核蛋白）。由于 MIF 通过非常规分泌途径分泌且未糖基化，因此将其用作阴性对照。MIF 分泌不受 Brefeldin A 或衣霉素抑制，Brefeldin A 或衣霉素存在时不诱导细胞凋亡。这些结果表明，分泌的 rpS3 通过典型的 ER-高尔基体途径进行 N-糖基化。分泌的 rpS3 是 N-糖基化的 为了确认分泌的 rpS3 的 N-联糖基化，使用抗 rpS3 抗体对浓缩的细胞培养基进行免疫沉淀，并用或不用 PNGase F 处理，PNGase F 可以去除 N-联聚糖。当用 PNGase F 消化时，与分泌的 rpS3 相当的条带显示出轻微的向下移动，表明分泌的 rpS3 被 N-糖基化。进一步进行凝集素结合分析以确认分泌的 rpS3 的 N 连接糖基化。Con A 是一种凝集素，可识别 α 连接的甘露糖和末端葡萄糖残基，赋予在细胞裂解物和浓缩培养基中分离 N-糖基化蛋白质的能力。如图所示，Con A 在细胞裂解物和培养基中均与 rpS3 结合，表明存在 N 连接聚糖。Con A 凝集素未检测到另一种核糖体蛋白，即活化蛋白激酶 C1 (RACK1) 的受体，这表明核糖体不与 Con A 相互作用，并且 RACK1 不是 N-糖基化的。MIF用作非糖基化蛋白的标记，而肿瘤坏死因子受体超家族成员6（FAS）用作N-糖基化蛋白的标记。结果证实分泌的rpS3是N-糖基化的。通过质谱分析鉴定rpS3中的N联糖基化位点为了鉴定rpS3中的N联糖基化位点，制备了大量的分泌型rpS3蛋白。使用 rpS3 抗体对富集的 HT1080 细胞培养基进行免疫沉淀。分离的rpS3通过大SDS-PAGE分离，然后用考马斯亮蓝染色。进行 MS 以确定哪些 Asn 残基是糖基化位点。将纯化的 rpS3 带进行 PNGase F 消化。由于 PNGase F 是一种酰胺酶，除去聚糖的 Asn 残基脱氨基为 Asp 残基，导致肽质量增加 1 个单位。胰蛋白酶消化后，通过 LC-MS/MS 选择性鉴定去糖基化的胰蛋白酶肽。每次 Asn 到 Asp 转化的肽质量增加 1 Da 用作鉴定糖基化肽的诊断特征。使用 Mascot 软件搜索质谱以了解 Asn 残基的脱氨作用。离子得分为 –10* Log (P)，其中 P 是观察到的匹配是随机事件的概率。超过 4 的单个离子分数表明所识别蛋白质的序列覆盖图具有同一性或广泛同源性 (P < 0.05)。观察到的肽离子占序列覆盖率的 46%。rpS3 中的三个 Asn 残基中的两个（Asn22 和 Asn165）被检测到，而 MS 未检测到 Asn57 肽。因此，我们构建了 N57G 和 NNGG 作为 Asn57 和 Asn165 的双突变。可以通过各种方式离子化的肽的分子量值如补充表S2所示。通过 LC-MS/MS 观察到的分子量以红色表示。检测到天然 Asn22，显示 Phe11-Arg40 肽分子量值。用 PNGase F 去除寡糖后的分子量显示在补充表 S2B 中。虽然在糖基化样品中检测到的 Asn22 分子量为 779.4046，但在去糖基化样品中其预期值为 780.3886，这与预期值不匹配。补充表 2C 和 D 显示了经过和未经 PNGase F 处理的 Phe152-Arg173 肽的分子量。在存在聚糖的情况下，观察到 Asn165 的分子量为 1100.5357，而在去糖基化样品中，肽离子的值被替换为 1101.5211。这意味着 1 Da 的增加是由于 Asn 到 Asp 的转换。综上所述，LC-MS/MS 数据表明分泌的 rpS3 在 Asn165 而非 Asn22 处被 N-糖基化。然而，Asn57 仍不确定，因为未检测到其片段。还，用稳定表达的 FLAG-rpS3 或 FLAG-N165G 表达的细胞进行糖蛋白分离后，通过免疫印迹检测准确证实了 rpS3 蛋白 Asn165 位点的糖基化结果 Asn165 是 rpS3 分泌的 N-糖基化位点 进一步检验 N-糖基化的作用rpS3 分泌上的糖基化位点，通过定点诱变修饰 rpS3 的 N-糖基化位点。然后将RpS3野生型和突变体（Asn57上的N57G突变、Asn165上的N165G突变和NNGG作为Asn57和Asn165上的双突变）稳定转染到HT1080细胞中。使用中所示的抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物和浓缩的细胞培养基。通过光密度扫描确定rpS3突变体相对于野生型rpS3的表达率。实验重复四次。在细胞裂解物中，除NNGG突变体外，N57G和N165G突变体的表达与野生型相当。此外，在我们之前的研究中[31]，我们证实热休克蛋白90（Hsp90）通过结合在rpS3蛋白的N端和C端来调节rpS3的稳定性。但是，结合位点尚未确定。因此，NNGG下降的原因可能是rpS3和Hsp90蛋白的结合与rpS3蛋白的这两个结构域（Asn57和Asn165）有关。有趣的是，如图所示，与野生型相比，N165G 突变体的分泌量减少（约 44%）。然而，N57G突变体显示出比野生型更高的分泌率（144%）。NNGG突变体的表达和分泌显着减少，表明分泌减少是由于细胞内的降解所致。还使用ELISA对突变体和野生型的分泌进行了分析。结果表明，rpS3 的分泌需要 Asn165 的 N-糖基化，而不是 Asn57。rpS3 的糖基化与癌症迁移和侵袭表型介导。我们之前证实，恶性细胞中分泌的 rpS3 蛋白水平增加 [7]。由于分泌的 rpS3 需要 N-糖基化，因此我们试图确认 rpS3 的糖基化是否与癌症恶性肿瘤相关。使用野生型 rpS3 (FLAG-rpS3) 或 rpS3 突变体 (FLAG-N165G) 进行伤口愈合和三维 (3D) 培养测定，鉴定迁移能力和细胞形状。在基质胶中孵育 3 天后，N165G 突变体 rpS3 显示糖基化显着降低。N165G细胞呈圆形，而表达 FLAG-rpS3 的细胞则在其前缘表现出定向排列。伤口愈合试验显示 rpS3 的 N165G 突变减少了癌细胞的迁移。与 3D 培养测定一样，在两种恶性癌细胞系上进行 7 天的孵育：HT1080 纤维肉瘤细胞系和 WM-115 人黑色素瘤细胞系，通过 si-RNA（人 si-rpS3/第777章 796 细胞中rpS3蛋白水平的降低导致侵袭性恶性癌细胞的形态发生向正常细胞的转变。这些结果表明 rpS3 的糖基化调节癌细胞的迁移和侵袭表型。rpS3的分泌和糖基化与癌细胞的恶性表型相关为了证实糖基化和分泌的rpS3调节癌细胞的侵袭性，我们在确认rpS3蛋白的分泌状态后通过糖蛋白分离来鉴定糖基化状态，通过3D培养测定来鉴定细胞形态在正常细胞系（人真皮成纤维细胞，HDF）、NIH3T3 小鼠永生化胚胎成纤维细胞和白血病癌细胞系（RBL-2H3 大鼠外周血成纤维细胞）中。RBL-2H3 细胞中的 RpS3 分泌增加，RBL-2H3 和 HT1080 细胞中的糖基化增加，但永生化细胞系中没有增加。此外，与正常细胞系 HDF 和 NIH3T3 相比，侵袭性癌细胞系 RBL-2H3、HT1080 和 WM-115 细胞系的侵袭性显着增加。攻击性较小的细胞系。特别是，显示非侵袭性细胞表型的正常细胞系HDF不分泌rpS3或糖基化rpS3。这些结果表明糖基化和分泌的 rpS3 蛋白与侵袭性细胞表型（例如恶性癌细胞）有关