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国际标准期刊号: 2090-4924
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帕特里克·巴里尔
低估 microRNA (miRNA) 关节的短暂和空间目标会导致与 miRNA 关节和细胞工作相关的重要数据丢失。无论如何，在（生理）神经质条件下检查 miRNA 的表达是测试 miRNA 关节的小尺寸和动态部分以及缺乏相关的纵向检查观察测试的结果。最近，我们建立了一个遗传变化表达框架来筛选内源性 RNAi 硬件的运动。该框架称为 RILES，代表 RNAi 诱导荧光素酶表达系统，该框架经过修改，以便由 miRNA 来开启荧光素酶质量的声明。最后，细胞中 miRNA 表达的有用性以生物发光标记的流出为标志，使用标准生物发光装置可以轻松观察到这些标记。我们通过检查小鼠骨骼肌中myomiRs的表达、肝脏中的miRNA-122以及miRNA-206在小鼠实体腐烂过程中的瞬时表达情况，对规则集中进行了全面的验证。生物发光测试产生了强大的信息，与 QRT-PCR 确定的 miRNA 关节设计密切相关。我们发现，RILES 还提供了一种前所未有的 miRNA 表达的全球测量研究，这使得能够收集有关 miRNA 工作的适用数据，这是传统检查方法无法做到的。由于 RILES 简单且灵活，
MicroRNA (miRNA) 是一类内源性非编码 RNA，长度为 18-25 nt，在转录后以明确的方式控制真核特性的表达。miRNA 对 mRNA 靶点具有权威性，特别是通过碱基匹配组件对 3'-非翻译区域 (3'UTR) 起作用。根据互补性的水平，miRNA 要么阻碍解释，要么引发目标 mRNA 的损坏。到目前为止，人类基因组中已识别出超过 1000 个 miRNA，预计它们将指导整个转录组的 60%。miRNA 参与大多数（如果不是每一个）细胞过程，从扩增、凋亡和分离到造血、形成规划和器官发生。沿着这些思路，
目前用于决定 miRNA 流出的技术极大地影响了我们对 miRNA 在生理和病理生理条件下发挥的自然作用的了解。虽然产生的信息无可争议，但它们需要空间目标，更重要的是，需要世俗目标。技术（例如基于 PCR 的方法）、微阵列、Northern 涂片和 ELISA 完全是干扰性的，需要复杂的组织检查和处理，使得这些策略无法用于在纵向研究期间观察 miRNA 指南。这是特别棘手的，因为 miRNA 是时空管理的，并且受到令人印象深刻的个体差异的影响。当 miRNA 的声明应该在整个生物体水平上进行探索时，这种多方面性质的源泉就变得越来越清晰。例如，众所周知，miRNA 在早期发展过程中受到精细指导，并控制与细胞遗传选择和形态发生相关的复杂的质量表达管理系统。此外，在恶性生长中，一些 miRNA 参与肿瘤改善的开始阶段，而在后期阶段，它们可以抑制转移的排列。因此，在特定时间点对来自异质人群的 miRNA 进行正常估计会损害 miRNA 指南的时间从属性质的有机相关性，就像个体水平上 miRNA 表达的异质性一样。因此，这些信息可能会导致与 miRNA 表达和细胞工作相关的重要数据丢失。解决这些障碍可能会直接影响基本和有用的考试领域。非侵入性亚原子成像策略可能可以克服这些限制，并提供一种选择性策略来考虑生理条件下的 miRNA 表达。尽管如此，在令人难以置信的生命形式中，对 miRNA 的持续检查基本上可以从 miRNA 的短长度中推断出来。这可以澄清书面报告的设定数量。主要的详细策略取决于荧光素酶记者质量的使用，将相关的方形分组传递给荧光素酶质量的 3'UTR 中的特定 miRNA。通过这种方式，当一个感兴趣的 miRNA 在细胞中传递时，它会与荧光素酶记录联系起来并抑制荧光素酶的产生。因此，细胞中 miRNA 的表达以生物发光信号的减弱为标志（系统外）。尽管如此，这种“阴性”成像方法还不够，因为生物发光信号的丢失可能反映了荧光素酶广告商的模糊指导甚至细胞通过。最近，正原子成像框架（ON-frameworks）的诞生就是为了克服这一障碍。这些框架的一部分取决于寡核苷酸原子参考点的利用，这些参考点的一侧有荧光团，另一端有猝灭剂。在靠近特定 miRNA 时，引导物的茎环结构被线性化，从而将荧光团与猝灭剂隔离开。因此，细胞中发出的荧光信号被视为与 miRNA 的分组相关。虽然这一进展说明了一种日益清晰的、体外完全认可的方法，但这种方法也有局限性，主要是荧光测试对小动物的影响力有限，并且对从体内嵌入的细胞传达的 miRNA 检查的应用有限。此外，由于需要在纵向检查的范围内重新组织测试，因此需要重要的复杂标准化方法。
在这里，我们描述了一种新的策略，RILES，在生物的整个身体大小上逐步筛选生理和病理生理条件下 miRNA 的动态表达示例。利用 RILES，我们史无前例地在小鼠模型中建立了 30 天时间内 miRNA 在动物疾病模型中的表达动态。我们的技术依赖于 cumate 质量开关框架的利用，其中 CuO（CymR 蛋白抑制子的管理员 DNA 限制序列）位于荧光素酶对应质量与其广告商之间。沿着这些思路，当 miRNA 有用时，CymR 阻遏物就不再产生，然后就可以传达荧光素酶专栏作家的质量。以这种方式，我们框架中的一个核心亚原子工具是 RNAi 颗粒（siRNA、miRNA、shRNA）具有显式诱导物的限制。这相对于常规方法来说是独特的，在常规方法中，关节框架的“开/关”布置受到外源诱导物（例如，cumate、抗生素药物或多西环素）的扩展的限制。该框架发挥作用的全部管理组件都聚集在一个单独的质粒中，以有效转染哺乳动物细胞，用于体外检查或体内生物发光研究。例如，cumate、抗生素药物或多西环素。该框架发挥作用的全部管理组件都聚集在一个单独的质粒中，以有效转染哺乳动物细胞，用于体外检查或体内生物发光研究。例如，cumate、抗生素药物或多西环素。该框架发挥作用的全部管理组件都聚集在一个单独的质粒中，以有效转染哺乳动物细胞，用于体外检查或体内生物发光研究。