临床试验杂志
开放获取

抽象的

使用 BNAClamp 实时 PCR 灵敏检测表皮生长因子受体 T790M

奥斯汀·丁克尔、雷切尔·A·霍夫迈斯特、安德鲁·哈克比、亚伦·S·卡斯特罗、米格尔·M·卡斯特罗、金成坤*

表皮生长因子受体 (EGFR) 突变会导致多种癌症，包括乳腺癌和肺癌。EGFR 酪氨酸激酶结构域上的单突变 T790M 表示对癌症药物吉非替尼的反应，从而导致对该药物产生耐药性。因此，检测突变为需要癌症药物治疗的患者提供了有效的治疗选择。我们寻求使用桥接核酸 (BNA) 开发一种简便、快速的 T790M 突变检测方法，众所周知，BNA 可以增强寡核苷酸的杂交亲和力。含有 BNA 碱基的寡核苷酸（称为 BNA-clamp）旨在阻断针对野生型基因的 PCR 反应，用于区分与大量野生型基因混合的突变基因的存在。实时 PCR 与 BNA 钳位结合使我们能够根据野生型和突变基因的比例观察不同程度的 PCR 扩增。为了探索这种可能性，我们用不同数量的 BNA 碱基制备了几种 13 聚体寡核苷酸夹。Tm值分析表明，含有9个BNA碱基的夹子（BNA-clamp-9）在区分突变体和野生型基因方面最为有效，并且使用BNA-clamp-9的敏感性测试表明，该夹子具有检测突变体和野生型基因的能力。野生型基因中 T790M 突变水平为 0.1% 或更低。此外，通过分子动力学 (MD) 模拟分析结合结构，表明 BNA-clamp-9 扭曲了最初构建的 BDNA 结构。此外，通过伞采样，野生型的结合自由能为-60 kJ/mol，突变型基因的结合自由能为-40 kJ/mol。这种 BNA 钳位和实时 PCR 技术可能为未来检测临床重要突变提供一种有前景的途径