生物医学数据挖掘国际期刊
开放获取

抽象的

龙石斑鱼神经坏死病毒的冷冻电镜原子结构与X射线衍射对比

林灿盛

抽象的

β-诺达病毒会导致四十多种鱼类致命的腐败。我将介绍冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 的引导，自 2001 年发布主引导以来，与 X 束衍射形成对比。在 10-20 Å 图谱的低目标时期，龙石斑神经坏死病毒 (DGNNV) 的亚原子亮点受到了认真的思考。感染样颗粒 (VLP) 是由在大肠杆菌、酵母或蠕动细胞中通讯的单个衣壳蛋白形成的，而当 N 端有 35 个氨基酸或 C 端有 4 个氨基酸时，没有发现 VLP。末端被抹去。天冬氨酸与阳离子合作的沉积被认为对于 VLP 的安全性至关重要，而半胱氨酸积累的潜在二硫键限制对于分子聚集来说并不是基本的。在 DGNNV 进入鱼细胞的途径中，提出了与热致晕蛋白 HSP90 样连接的小胞饮作用，同时利用 X 束折射探索膨胀区域与脂质结合蛋白的详细配合。利用 X 束衍射将缩短克隆中衣壳蛋白的三个区域（RNA 结合、外壳和投影空间）解析为 4-6 Å。尽管在投影时发现了另一个阳离子限制位点，但自 2001 年以来提出的 Betanodvirus 结构得到了双重确认。最近，带有即时定位相机的冷冻电镜可以解决示例运动和辐射伤害问题，从而接近 T=3 DGNNV VLP 的核结构。基础条件脆弱的壳空间结构（第 52-213 个氨基酸）被解析为 3。56 Å 目标和重新组装的核模型揭示了蛋白质-蛋白质连接、钙-颗粒延伸和特殊阳离子协作。阳离子缔合通过将三个亚基固定在不平衡的三聚体单元中并将错误的单元固定成二十面体来稳定分子，并且它们的修饰促进了分子的发育或干扰。冷冻电镜结构在复制内吞作用通道的酸性条件下浸没后发生变化，建议鱼 NNV 装置使用 pH 检测组件来传递其基因组。阳离子缔合通过将三个亚基固定在不平衡的三聚体单元中并将错误的单元固定成二十面体来稳定分子，并且它们的修饰促进了分子的发育或干扰。冷冻电镜结构在复制内吞作用通道的酸性条件下浸没后发生变化，建议鱼 NNV 装置使用 pH 检测组件来传递其基因组。阳离子缔合通过将三个亚基固定在不平衡的三聚体单元中并将错误的单元固定成二十面体来稳定分子，并且它们的修饰促进了分子的发育或干扰。冷冻电镜结构在复制内吞作用通道的酸性条件下浸没后发生变化，建议鱼 NNV 装置使用 pH 检测组件来传递其基因组。

介绍

在 Nodaviridae 家族中，由 180 个 CP 组成的阵列构造了一个 T = 3 的衣壳，其距离约为 29 − 35 nm。CP通常由中心果酱移动地理制成，用两组对等的β-片形成眼对眼的β-三明治。在甲诺大病毒分子的聚集过程中，先行蛋白质α的自催化裂解产生蛋白质β和γ ，这是衣壳辅助发育所必需的。β蛋白构建了等β链的权威八敌，其N端和C端位于感染分子内。β蛋白极其重要的 N 端需要杀死衣壳化的RNA双链体；它同样作为亚原子变化来控制粒子的异质尺寸和状态。尽管在系统发育关系中存在巨大的发育分离，但甲病毒科不同毒株之间的基本互补性似乎得到了保存。无论如何，α诺大病毒和β诺达病毒之间的CP排列不存在巨大的同源性。从不同石斑鱼物种中分离出来的 RGNNV 株 Betanodavirus 的基因型，例如橙斑石斑鱼焦虑腐败感染 (OSGNNV)、龙石斑鱼焦虑腐败感染 (DGNNV) 和马拉巴里库斯石斑鱼焦虑腐败感染 (MGNNV)，包含深度调节的基因组。MGNNV CP的三个连续重要空间，包括N端区、最近通过冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 成像在 23 Å 目标和 3D-PSSM 预测中集中显示了β夹心表面积和三聚体膨胀空间。尽管如此，目前还没有关于乙型诺达病毒衣壳相关关联的高水平基础数据。

在本报告中，我们描述了 Betanodavirus 家族石斑鱼焦虑性腐败感染 (GNNV) 不同结构的宝石结构：(I) 总 T = 3 GNNV 样分子 (GNNV-LP)，目标尺寸为 3.6 Å；(ii) T = 1 个 3.1 Å δ-P 区畸形的亚病毒颗粒 (SVP)；(iii) 7.0 Å 处的 N-ARM 取消异常；(iv) 1.2 Å 处 GNNV CP 的单独 P 空间。GNNV-LP 的宝石结构显示了衣壳工程中的一些关键和特殊的变化，以及衣壳亚原子成分的聚集，与αnodavirus 和其他 RNA 感染的变化形成对比。具体来说，我们已经认识到GNNV上外壳空间的配给基本品质。不同类型的 T = 3 和 T = 1 GNNV 衣壳表明，N 端富含精氨酸的主题 (N-ARM) 作为亚原子开关发挥作用。第二，P区，以其 DxD 主题以及两个结合的 Ca2+ 颗粒，在 GNNV CP 的三聚和分子聚集中发挥着重要作用。这些高目标的基本细节进一步有助于我们从上到下理解病毒聚集和污染的原子组成部分，并且应该为思考诺达病毒科的发展提供辅助前提。

方法

每一次动物尝试都是在严格理解国立成功大学机构动物护理和使用委员会指南中的建议的情况下进行的。该公约得到了国立成功大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的确认 (IACUC #100065)。

GNNV 分子和缩短的 GNNV CP 的创建和净化

来自橙斑石斑鱼焦虑性腐败感染 (OSGNNV) RNA2（GenBank 促销号 KT071606）的一致 CP DNA 排列通过 PCR 增强，并克隆到携带 6×组氨酸沉积物和酵母 SUMO (SMT3) 的调整 pET32-Xa/LIC 载体中作为N端组合标签[54]。该培养物在大肠杆菌 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL (Stratagene) 中传播，并在含有氯霉素 (34 μ g/ml) 和氨苄青霉素 (100 μ g ) 的 Luria Bertani (LB) 库存 (Merck) 中精制细胞/ml) 直至 37°C、600 nm 处 OD 达到 0.6–0.7。IPTG（异丙基β将-D-硫代半乳糖苷）（Bioshop）添加到最后一组 0.5 mM 中，并暂时在 18°C 下孵化群落。收集细胞并在裂解摇篮（50 mM Tris HCl (pH 8.0)、0.25 M NaCl、20 mM 咪唑、5 mM β-巯基乙醇和 1 mM EGTA ）中进行超声处理。通过 Ni-NTA 部分（GE Healthcare）对 CP 进行净化。SUMO 标签利用 SUMO 蛋白酶进行分割，随后用 Ni-NTA 片段将其排出。

将清洁的 GNNV CP 弱化至 0.3 mg/ml 的分组，并暂时在 4°C 下对不含 EGTA 或β-巯基乙醇（比例为 1:150）的裂解垫进行透析。将 (NH4)2SO4 (750 mM) 添加到透析中，最后将 GNNV CP 对 GNNV-LP 排列垫（20 mM Tris HCl (pH 8.0)、0.2 M NaCl、1% (v/v)）进行透析甘油和 2 mM CaCl2)。GNNV-LP 的大小通过 Superose 6 10/300 GL 切片（GE Healthcare）上的尺寸避免色谱法估计。将净化后的 GNNV-LP 浓缩至 30 mg/ml，并保存在 4°C 下。

结果

T = 3 GNNV-LP 的二十面体结构

SUMO-GNNV CP 在大肠杆菌 (E. coli) 中过表达，GNNV-LP 在体外自行收集。从电镜照片来看，GNNV-LP的形态显示T=3衣壳，尺寸为30~35 nm。我们利用胃肌起始技术和非晶体平衡 (NCS) 平均确定了 T = 3 GNNV-LP 的宝石结构，并将结构细化至 3.6 Å。T = 3 GNNV-LP 的二十面体不平衡单元 (iASU) 的电子厚度允许显示亚基An 和 B 的沉积物52 – 338，以及亚基 C 的堆积物 34 – 338。每个包含 N-ARM（明确富含精氨酸的主题 23RRRANNRRRSN33）的子单元都感到困惑。

GNNV CP 的一般拓扑结构由 N 端臂（N 臂）（沉积物 34 - 51）、壳空间（S 区）（堆积物 52 - 213）、连接区（沉积物 214 - 220）组成。 ）和凸起空间（P 区）（沉积物 221 – 338）。布置的N臂沿着内表面的二十面体二重叠(I2)界面存在，并且将其N端延伸至二十面体三重叠(I3)枢轴以构成β环。S空间涉及一个等β三明治的八个废弃敌人和三个短α-螺旋，与其他感染CP一样，是一种公认​​的辅助元素。GNNV CP 的各个 S 区和 P 区（由适应性链接区相关联）彼此之间不能合法地协作。P 空间折叠成一个自主结构，包括八个相等β链的敌人和与不同长度的圆相关的短α螺旋。

六十个三聚体 S 空间参与亚基接触之间，形成具有空内孔的持久细长衣壳外壳。每个 iASU 的三个相邻 P 空间在半三重叠 (Q3) 战斧上相互抓住，在分子表面形成 60 个投影。来自亚基 A、B 和 C 的三个相邻单体 S 区域沿着 I2、I3 和二十面体五重叠 (I5) 战斧被二聚体、三聚体和五聚体通讯占据。尽管 GNNV CP（338 个沉积物）比 αnodavirus CP（407 个堆积物）短，但 GNNV 衣壳与其 60 个巨大突起的基本关联揭示了 T = 3 设计，其分子大小类似于缩小的 alphanodavirus结构，其中 CP 的 N 端和 C 端均位于衣壳内部。

讨论

在诺达病毒科中，RNA2编码分子聚集所需的CP并具有特殊性。来自诺达病毒科代表 CP 的一组协调的氨基腐蚀分组的系统发育树表明，甲诺达病毒和贝塔诺达病毒以不同的遗传方式开始，并被分离成一个值得注意的、特殊的亲子关系。 

致谢

我们感谢台湾国家同步辐射研究中心 (NSRRC) 光束线 BL13B1、BL13C1 和 BL15A1 的工作人员以及台湾合同光束线 BL12B2 的工作人员以及日本 SPring-8 BL44XU 的 Eiki Yamashita 的专业帮助。提案编号 2012A4009、2012A6760、2012A6600、2012B4002、2012B4012、2012B6600、2013A4011、2013A6600、2013B4000、2013B6600、2014A400 0、2014A6600、2014A6965 和 2014A4004。我们要感谢王廷芳提供的 SUMO 关节矢量。我们对 Christina Ling Chang、Yee-Shin Lin 和 KC Han-Ching Wang 的重要对话表示感谢。该检查的部分内容是在国立成功大学（NCKU）生物科学与生物技术中心的 NSRRC-NCKU 蛋白质晶体学实验室完成的。