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国际标准期刊号: 2090-4924
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抽象的通过数据进行毒性途径研究，特别是在其定制的细胞死亡之前在毒物奖励细胞中发生的上游反应系统，可以提供一种公平的方式来处理选择手机最终命运的放松变化。我们通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学联合方法，研究了细胞毒剂杨梅苷对引入细胞毒剂后细胞调整的影响。通过测试集引入杨梅苷后，在细胞传递之前发生的转录组变化突出显示了具有染色体稳定性功能的群体的变化，例如下调的异质原子核糖核蛋白（HNRNPM）。那些从事多功能碳消化的人，例如，精氨基琥珀酸合酶（ASS1）上调，被认为是中毒后的中间反应。N2a 细胞暴露于细胞毒剂 18 至 24 小时后，细胞内 ATP 和线粒体直立性仍接近对照水平，并伴有明显的代谢组变化。随着活力消化的改变，葡萄糖水平和氧化压力（蛋氨酸亚砜排列）发生了变化。使用磷酸肌酸和等量的肌酸表明细胞活力摇篮疲劳。谷胱甘肽（GSH）在对抗不断扩大的细胞忧虑方面的明显作用是在细胞稳态崩溃之前进行早期调整而受到关注。p38 图激酶介导的 p53 上调 caspase 3 导致细胞凋亡的直接信息已被解释并将进行检查。N2a 细胞暴露于细胞毒剂 18 至 24 小时后，细胞内 ATP 和线粒体直立性仍接近对照水平，并伴有明显的代谢组变化。随着活力消化的改变，葡萄糖水平和氧化压力（蛋氨酸亚砜排列）发生了变化。使用磷酸肌酸和等量的肌酸表明细胞活力摇篮疲劳。谷胱甘肽（GSH）在对抗不断扩大的细胞忧虑方面的明显作用是在细胞稳态崩溃之前进行早期调整而受到关注。p38 图激酶介导的 p53 上调 caspase 3 导致细胞凋亡的直接信息已被解释并将进行检查。N2a 细胞暴露于细胞毒剂 18 至 24 小时后，细胞内 ATP 和线粒体直立性仍接近对照水平，并伴有明显的代谢组变化。随着活力消化的改变，葡萄糖水平和氧化压力（蛋氨酸亚砜排列）发生了变化。使用磷酸肌酸和等量的肌酸表明细胞活力摇篮疲劳。谷胱甘肽（GSH）在对抗不断扩大的细胞忧虑方面的明显作用是在细胞稳态崩溃之前进行早期调整而受到关注。p38 图激酶介导的 p53 上调 caspase 3 导致细胞凋亡的直接信息已被解释并将进行检查。随着活力消化的改变，葡萄糖水平和氧化压力（蛋氨酸亚砜排列）发生了变化。使用磷酸肌酸和等量的肌酸表明细胞活力摇篮疲劳。谷胱甘肽（GSH）在对抗不断扩大的细胞忧虑方面的明显作用是在细胞稳态崩溃之前进行早期调整而受到关注。p38 图激酶介导的 p53 上调 caspase 3 导致细胞凋亡的直接信息已被解释并将进行检查。随着活力消化的改变，葡萄糖水平和氧化压力（蛋氨酸亚砜排列）发生了变化。使用磷酸肌酸和等量的肌酸表明细胞活力摇篮疲劳。谷胱甘肽（GSH）在对抗不断扩大的细胞忧虑方面的明显作用是在细胞稳态崩溃之前进行早期调整而受到关注。p38 图激酶介导的 p53 上调 caspase 3 导致细胞凋亡的直接信息已被解释并将进行检查。谷胱甘肽（GSH）在对抗不断扩大的细胞忧虑方面的明显作用是在细胞稳态崩溃之前进行早期调整而受到关注。p38 图激酶介导的 p53 上调 caspase 3 导致细胞凋亡的直接信息已被解释并将进行检查。谷胱甘肽（GSH）在对抗不断扩大的细胞忧虑方面的明显作用是在细胞稳态崩溃之前进行早期调整而受到关注。p38 图激酶介导的 p53 上调 caspase 3 导致细胞凋亡的直接信息已被解释并将进行检查。
介绍
神经母细胞瘤是青春期最常见的颅外肿瘤。到目前为止，大多数转移（M）期患者在结束和倒退时都在骨髓（BM）中出现分散的肿瘤细胞（DTC）。尽管这些细胞在神经母细胞瘤患者的治疗中具有显着的威慑力，但对其行为特征的了解仍然很微妙。目前对 4/M 期原发性肿瘤的 RNA序列研究，增强了 BM衍生的示范性 DTC 和倒退 DTC，以及相关的 BM肿瘤与肿瘤相比，来自 53 名患者的单核细胞 (MNC) 发现了 DTC 中的 322 个差异通讯特性 (q < 0.001，|log2FC|>2)。特别是，DTC 中线粒体 DNA 编码的记录程度有所提高，但与血管生成相关的质量等却被下调。此外，224 种品质在 DTC 中得到了很好的传达，而在跨国公司中则有一定程度的传达（q < 8 × 10−75 log2FC > 6）。令人惊讶的是，我们发现后退 DTC 的转录组通常与指示性 DTC 的转录组相似，在松散的情况下仅具有 113 个差异传达的品质……偏移（q < 0.01，|log2FC|>0.5）。引人注目的是，后退 DTC 表明 19 号染色体上 31 个下调品质的位置改善，包括 5 个肿瘤沉默品质：SIRT6、BBC3/PUMA、STK11、CADM4 和 GLTSCR2。神经母细胞瘤 DTC 的首次 RNA测序检查揭示了它们与肿瘤和 MNC 相比独特的表达谱，以及症状性 DTC 和倒退 DTC 之间较少表达的对比。
最后一个特别影响的是 19 号染色体编码的品质下调。由于这些调整可能与治疗失望和疾病倒退有关，因此应该考虑对 DTC 进行进一步的功利主义研究。
神经母细胞瘤是在生命第一年分析中最广泛认可的强肿瘤。它被描述为一种截然不同的临床行为，从无限制的复发或发展到危险的疾病。这种多样性根本上是由于肿瘤本身不可预测的科学和遗传特性。虽然具有阳性临床结果的肿瘤尽可能频繁地显示出数值染色体变异，并且偶尔出现基本变异，但具有不祥临床结果的神经母细胞瘤通常由节段性染色体异常和 MYCN 强化 (MNA) 来描述。深??测序检查为肿瘤的基因组情况提供了更多的经验，发现染色体碎裂以及特定质量的变化和删除与不同频率的高风险疾病相关。5、6此外，已经做出努力以改善我们对神经母细胞瘤转录组场景的理解。这些检查大部分研究了基于神经母细胞瘤分类器的质量表达的预后估计，从而改进了临床终点预测。
尽管所有这些基因组学和转录组学研究都推动了我们对这种疾病的理解，但它们从根本上来说都集中在原发性肿瘤上。尽管如此，神经母细胞瘤的一个典型特征是转移性 (M) 期患者的骨髓 (BM) 中扩散的肿瘤细胞 (DTC) 接近。超过 90% 的 M 期患者在诊断时就表现出 DTC 侵入 BM。10 在一年半以上的患者中检测到 BM 中的 DTC 具有很高的预后意义，因为这些患者经常会经历以下情况：疾病重复和不良结果的不良影响。11 重要的是，BM 可用于可忽略的剩余疾病 (MRD) 的亚原子评估和结果预测。
在我们正在进行的研究中，我们已经证明 BM衍生的DTC 对于基因组和转录组检查是合理的。此外，事实证明，DTC 对于复发“播种克隆”的可识别证据具有深远的指导意义。尽管如此，人们很少考虑 DTC 在扩散和肿瘤移动时发生的质量变化。到目前为止，只有一个团队对 BM 进行了高质量的关节分析......通过微阵列研究从 11 名神经母细胞瘤患者中提取 DTC。在这次检查中，莫兰迪等人。主要围绕示范性 DTC 和原发性肿瘤之间差异传达的质量 ID 进行，以区分可以作为高风险神经母细胞瘤患者的预后标志物的质量。
材料和方法
重要的肿瘤和骨髓测试被保存在液氮中。准备好肿瘤的冷冻切片载玻片并进行 H&E 染色。将识别出的肿瘤细胞丰富区从各个肿瘤块中取出，并在 QIAzol (Qiagen) 中用gentleMACS Dissociator (Miltenyi) 匀浆。将二甲基亚砜 (DMSO) 固化的 BM 抽吸的 MNC 部分解冻，并进行厚度倾斜离心 (LymphoprepTM, AXIS �? � SHIELD PoC AS)。厚度斜率离心后，DTC 被命名并在 4°C 下进行，如前所述。总之，将含有DTC的MNC部分经过厚度倾斜分割后收集起来，并用磷酸盐清洗。缓冲盐水 (PBS)，300g，4°C 10 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 2 ml 冰冷磁力激活细胞排列 (MACS) 摇篮中（PBS pH 7.2、0.5% 牛样血清蛋清、2 mM 乙二胺四乙酸腐蚀剂） 。从那时起，细胞悬浮液在 4°C 下用 2.5 µl FITC标记的抗GD2抗体（14.18 delta CH2 克隆）孵育 20 分钟，然后用 75 µl 孵育 15分钟。 4°C 时抗FITC吸引球 (Miltenyi)。MACS排列在4°C下进行，增强的DTC部分和相关肿瘤细胞??。耗尽的 MNC 部分独立收集并在 QIAzol 中均质化。
按照制造商的惯例，使用 miRNeasy Micro Kit (Qiagen) 提取所有 RNA。去除的 RNA 的数量和可信度分别通过 Qubit RNA HS 检测试剂盒 (Life Technologies) 和 Experion RNA StdSens 检测试剂盒 (BioRad) 进行了调查。
按照用于 Illumina 惯例的 NEBNext Ultra RNA 文库制备试剂盒 (New England BioLabs) 与 Poly(A) mRNA 磁力分离模块 (New England BioLabs)，使用30 ng的全部 RNA 进行 cDNA 混合。cDNA 混合后，文库在 EMBL 基因组学核心设施（德国海德堡）通过计算机化途径完成。RNA测序在 Illumina HiSeq 2000 平台上进行。每个路径汇集 6 个示例，并创建 50 bp单端读取。
正常的粗 RNA 测序产量为每次测试 3600 万 (M) 次读取（运行 12-172 M），其中 16 M 次读取（44%）有趣地计划到蛋白质编码外显子（延伸 5-74 M）。 秘鲁计划使用 GSNAP v2014 �? � 12–2818 (“– maxsearch = 100 – npaths = 1 – max �? � 不匹配= 1 – 小说拼接 = 0”) 到人类参考 GRCh37，然后分配给 Ensembl 质量模型（制造 75） ) 利用 HTSeq19 ("htseq �? � count �? � f bam �? � t exon �?s no”）。在读取计数之前，rRNA 质量已从 Ensembl 质量集中排除，从而避免了随后的每一次调查。已知的单核苷酸多态性 (SNP) 和 GSNAP 的移植位置与数据库 SNP (dbSNP) 构建体分离138和Ensembl GRCh37分别制作了75个。在读取计划和检查后，使用DESeq220来调用差分通信质量（nbinomWaldTest，minReplicates = 5，cooksCutoff = 0.7，trim = 0.4）。此外，我们使用DESeq2来生成标准化的（工作“fpm”，稳健= TRUE）和方差??稳定（工作“vst”）质量清晰度网格，用于导入 Qlucore v3.2 并在其中进行进一步检查。本次检查中使用的所有示例均通过了内部质量控制 (QC) 检查，包括碱基特性、计划率、重复率和 5'–3' 包含，这些检查是根据 FastQC 和 RSeQC 报告进行的。
结果
DTC 在 BM 中的代表性通常不足，这需要在质量衔接检查之前对其进行改进。免疫荧光 (IF) 显微镜显示，BM 抽吸中 GD2POS 肿瘤细胞的中间渗透率 (n = 42) 在增强前为 20%（运行 1%–80%），增强后为 65%（区域 19%–96%）基于吸引力珠??的改进(图(图22a)。改进后的DTC含量为样品??。增强后，27% 的测试包含 <50% DTC，37% 的测试包含一半 75% DTC，37% 的测试包含 >75% DTC。一般来说，技术进步使 DTC 测试中肿瘤细胞含量增加了三倍。负分部 (MNC) 由 IF 进行分析，所有具有明显 GD2POS DTC 的示例均被禁止进一步调查。
我们预计全球质量清晰度示例的对比在很大程度上是由细胞类型驱动的（为了方便起见，我们在本文中将肿瘤、DTC 和 MNC 测试命名为特定细胞类型）。毫无疑问，所有质量的头段检查都转化为肿瘤和跨国公司，沿着主要头段（x轴）的细胞类型明确地分离了示例，肿瘤测试（16个分析示例）分组到一侧，跨国公司测试（ n = 28：一侧有 14 个指示性示例和 14 个倒退测试）。在??在这两个束之间，沿着相似的支点，DTC（n = 42：22 次分析测试和 20 次倒退测试）因其肿瘤细胞含量而消散。MYCN 清晰度状态澄清了肿瘤和 DTC 测试（第二头段，y轴）中绝大多数其余质量清晰度不一致的情况，揭示了 MYCN 上调对全球肿瘤质量清晰度的实质性影响（n = 6） MYCN低，n = 10，MYCN高）和 DTC（n = 26，MYCN低，n = 16，MYCN高）。GSEA for DTC MYCN �? � 高和 MYCN �� 低测试发现了一些最近描述的 MYCN �?相关质量，包括包含与原发性神经母细胞瘤中 MYCN 上调共同调节的质量的质量集。此外，对 MYCN高和 MYCN低DTC 之间的前100 个差异通讯质量进行独立分组，通过 MYCN 清晰度（而不是细胞类型或肿瘤细胞含量）测试分离的肿瘤和 DTC。DTC MYCN 中的 76 个品质上调了 �?高测试，MYCN 本身是最根本上调的质量（q = 3.7 × 10−51，log2FC = 4.9）。除了一例（D04d，用 82% 肿瘤细胞进行测试）外，MYCN 表达水平与荧光原位杂交 (FISH) 以及 SNP 簇（补充信息表 S1，附加数据为D04d)。根据 SNP 的指示，D04d 和协调肿瘤测试包含大约 25-30 个 MYCN 重复项。遗憾的是，由于本例中 RNA 损坏，无法获取相关肿瘤的清晰数据。剩下的 24 种品质在 DTC MYCN �? � 高测试中被下调。尽管事实上 MYC 并未跻身前100 名定向品质，但在 DTC MYCN 中却被下调。高测试（q = 0.006，log2FC = 1）。
讨论
BM是不同恶性生长类型的DTC的持续归巢器官。它可以作为 DTC 的转移特征，而 DTC 最终会导致治疗后疾病复发。沿着这些思路，DTC 的接近程度被认为是不同恶性生长类型（例如胸部恶性生长、尤文肉瘤和神经母细胞瘤）无助结果的重要预后标志，但 MS 期肿瘤除外，这些肿瘤通常表现出轻微的症状。尽管大多数情况下疾病结果很严重，但仍将 BM 纳入其中。3, 34 因此，DTC 的描述可能有助于提高我们对治疗失望和感染倒退的认识。
我们通过分解指示性和后移 DTC 的质量发音曲线来扫描疾病期间发生的发音变化。突然之间，分析性 DTC 的转录场景在很大程度上追随了倒退 DTC 的转录场景，尽管这些患者已经接受了多模式治疗。这种看法可能会通过防御性 BM 专业得到澄清，就像已经表明的那样，BM 微环境会提高他们的耐力、迟钝、发育和耐药性。 35 值得注意的是，我们发现症状性 DTC 和倒退 DTC 之间差异传达的品质表明19 号染色体上的位置增强，五种肿瘤沉默子质量在后退 DTC 中下调。尽管 19 号染色体缺失在神经母细胞瘤中很少见，但一些研究表明，在低复发率的原发性肿瘤中存在擦除或重复无偏杂合性丢失 (cnLOH)。奇怪的是，我们正在进行的调查发现，与指示性 DTC 相比，后退患者 DTC 中 19 号染色体部分取消的复发率更高。 15 尽管我们和其他检查中大多数宣布的 19 号染色体删除影响了 q??臂，我们发现绝大多数差异通信的质量是由 p ??臂编码的。虽然 q臂上的质量下调至少可以通过删除特定质量来澄清，但 p臂中不常见的质量取消提出了其他反式监管组成部分质量清晰度。通过这种方式，表观遗传学认为专注于 DTC 似乎是明智的，并且可以更深入地了解这些细胞中发生的转录组修饰。
19 号染色体编码了一些备受关注的肿瘤沉默基因，其下调与不同疾病的发生有关。我们认识到其中五种肿瘤沉默品质在后退 DTC 中被下调。BBC3/PUMA 是一种基本的细胞凋亡诱导剂，其关节去除具有致癌性，可促进有益的梗阻。一份正在进行的报告显示，BBC3/PUMA 是对 p53 激活产生有益反应以及由 Nutlin3a 引发的随后细胞凋亡的基本决定因素，Nutlin3a 是一种正在进行临床试验的恶性生长疗法。 40 筛选浓缩物氟苯达唑，另一种应用抗 β 酶抑制剂的加剧剂。 � 癌症作用，公认神经母细胞瘤是氟苯达唑潜在的敏感疾病因素。Nutlin 扩大了氟苯达唑的充足性3 、氟苯达唑尚无诱导抗...在所检查的神经母细胞瘤细胞系中，当 BBC3/PUMA 耗尽时，神经母细胞瘤的影响完全减弱。SIRT6 是另一种肿瘤沉默因子，我们认为它在后退 DTC 中下调，其不幸与一些疾病的无助结果有关。对癌症基因组图谱数据库信息的检查发现，20% 的解剖恶性肿瘤中 SIRT6 被删除。倒退测试的 DTC 中剩余三个消音器特性（具体为 STK11、CADM4 和 GLTSCR2）的不幸和下调，也被认为与其他恶性肿瘤中的肿瘤运动有关。通过这种方式，我们认为，后滑 DTC 中 19 号染色体编码的五种肿瘤沉默子质量的下调表明了 DTC 的潜在耐力优势。
此外，我们发现与转移起始和血管生成相关的品质在原发性肿瘤中上调，而不是 DTC 和 MNC，它们存在于深度血管化的 BM 中。 44 除了这些品质的下调之外，DTC 还特别通过 mtDNA 的扩展测量来描述。以及这个小基因组编码的相关记录。确实，与原发性肿瘤相比，BM衍生的跨国公司的 mtDNA 记录也有所提高，尽管本质上不完全是 BM 。派生 DTC。线粒体数量的增加是不同恶性肿瘤的标志性特征，值得注意的是，线粒体在残酷的情况下赋予疾病细胞令人印象深刻的适应性，例如缺氧 BM。 45 然而，DTC 中由 mtDNA 编码的记录的增加程度是有点令人惊讶，因为这些品质只编码少数对有用线粒体至关重要的亚基。迄今为止，大多数亚基（例如 OXPHOS 复合物）都是由 nDNA 编码的。然而，出乎意料的是，这些品质在 DTC 中并未得到上调。对这一奇迹的一个潜在的解释是肿瘤细胞从骨髓微环境中摄取功利性线粒体。任何状况之下，实践检验对于理解 mtDNA 增加的具体系统和原因以及由其编码的记录程度的扩展非常重要。除了这些和不同的对比之外，DTC 还具有肿瘤的致癌特征。特别是，MYCN的记录在肿瘤和DTC测试中是等效的，正如之前被证明具有抗肿瘤作用的MYC的记录一样。??与神经母细胞瘤中的 MYCN相关。