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Frataxin基因致病性GAA重复删除中控制CjCas9表达的两种方法

普伊雷·亚梅奥戈

 

 大多数弗里德里希共济失调病例是由于在 frataxin 基因的第一个内含子中插入 GAA 重复序列 (GAAr) 导致蛋白质表达减少而引起的。通过 CRISPR-Cas9 技术删除该 GAAr 会导致 frataxin 表达增加。由于 AAV 包装大小有限，SpCas9 去除 GAAr 需要两种腺相关病毒 (AAV)。使用 2 个 AAV 会降低潜在治疗的效率，因为每个细胞都必须被两种病毒感染。因此，我们使用了 CjCas9，因为它足够小，可以通过单个 AAV 传递两个 sgRNA。然而，AAV 在体内传递的 CjCas9 基因的组成型表达可能会增加脱靶突变并诱导针对 Cas9 蛋白的免疫反应。时间表达对于 CRISPR 系统很重要。

首先，分子Hara Kiri，我们在HeLa细胞中同时转染编码CjCas9的质粒、两个针对frataxin基因的引导物（GAAr前和后）和两个针对CjCas9基因的引导物。我们的结果表明，尽管 CjCas9 基因自我破坏，但 FXN 基因在体外获得了有效的基因组编辑。

其次，CRISPR-SCReT（终止密码子通读），我们在CjCas9基因的开头插入终止密码子（TGA）以抑制其表达。随后，我们通过能够允许翻译的分子诱导 Cas9 的表达，尽管存在提前终止密码子。该质粒用两种 sgRNA（GAAr 前和 GAAr 后）转染至 293T 细胞中。我们注意到仅在用 G418 处理的细胞中删除了 GAAr。

这些不同的方法允许对 frataxin 基因进行有效的编辑，同时防止 Cas9 的持续表达。这可以减少脱靶突变和针对 Cas9 蛋白的免疫反应的机会。