酶工程
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印度鲤鱼脂肪酶的分离、纯化、二级结构表征和动力学研究

Kameshwar Sharma YVR、Neelima Boora 和 Prasidhi Tyagi

脂肪酶是普遍存在的酶，其在水脂界面催化脂肪水解成脂肪酸和甘油，并在非水介质中逆转该反应。脂肪酶因其在油脂化学、有机合成、洗涤剂配方和营养方面的新颖和多重应用而在生物催化剂中占有重要地位。脂肪酶是从喀拉鲶 (catla) 的消化道和消化肠中提取和分离的。将组织与起始缓冲液（0.01 M TrisHCl，pH 7.2）以 1:3 的比例匀浆。使用硫酸铵(20-80％)沉淀由此获得的粗提取物。通过透析去除过量的盐，并将所得透析液（脱盐酶）以0.5ml/min的流速进行DEAE-纤维素柱进行离子交换色谱。通过起始缓冲液中的 NaCl (100-800 mM) 逐步梯度进行洗脱。活性级分汇集为纯化级分 (PF)，用于 pH、温度和钙对酶活性的影响的物理表征、结构表征、分子表征以及动力学研究。纯化组分 (PF) 的最终比活性为 1438.72 U/mg。最适pH为7.8，最适温度为20℃。纯化脂肪酶的熔解温度(Tm)值为42℃，活化能为34.82 KJ/mol/K。发现脂肪酶的热稳定性为20℃。在起始缓冲液中加入 10 mM 和 20 mM CaCl2 后，脂肪酶活性保留长达 3 小时。这表明钙具有增强酶变性的特性。来自印度鲤鱼、catla 的脂肪酶水解 pNPP 的米氏常数 (Km) 为 6.695 mM。脂肪酶(catla)的周转数(kcat)为0.0022s-1。脂肪酶的催化效率(kcat/Km)为0.0003412 s-1 mM-1。纯化脂肪酶 (PF) 的 SDS-PAGE 显示分子量为 70 kDa 的均质单条带。使用圆二色性对纯化脂肪酶的α螺旋和β链的二级结构排列结果分别为48.51%和9.74%。