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抽象的

体内 β1-肾上腺素能受体磷酸化状态的测定策略

林幸三和小林博之

β1-肾上腺素能受体 (Adrb1) 是 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 超家族的成员，是心脏功能的关键调节因子。所有GPCR在多个位点被磷酸化，并且特定的磷酸化模式充当“条形码”，以组织特异性的方式调节受体功能和下游生理过程。然而，由于缺乏特异性抗体，人们对Adrb1磷酸化位点在体内的位置和功能知之甚少。作为确定体内小鼠心脏中 Adrb1 磷酸化状态和相关功能的第一步，我们制定了以下实验策略：1) 使用先进的磷酸化蛋白质组学技术鉴定离体灌注小鼠心脏中激动剂依赖性 Adrb1 磷酸化位点；2) 通过从 Adrb1 过表达 HEK 293T 细胞获得的高质量质谱 (MS) 数据确定这些磷酸化位点；3) 产生表达 Adrb1 的敲入 (KI) 小鼠，该小鼠在 N 末端与 FLAG 标签融合，用于免疫亲和纯化，以揭示活体内的磷酸化状态；4) 通过磷酸化肽与相应的未磷酸化肽离子强度比的 MS 测量，阐明 KI 小鼠心脏中 Adrb1 特定位点的磷酸化水平。使用这种策略，我们将 Adrb1 C 末端的 Ser462 鉴定为灌注小鼠心脏中的激动剂依赖性磷酸化位点。我们还揭示了 KI 小鼠中 Ser274 (0.25)、Ser417 (0.55) 和 Ser462 (0.0023) 的基础磷酸化比率。这些发现为通过位点特异性磷酸化介导的 Adrb1 功能调节机制提供了新的见解。